GST-pulldown分離CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白,及亲和差异性的分析.docVIP

实验设计：GST-Pulldown分离CA-CaRop1和DN-CaRop1的互作蛋白，及亲和差异性的分析 一、重组诱饵蛋白的获得（DN-GST, CA-GST） 融合蛋白的诱导表达 一扩，挑取克隆到试管中摇荡培养7h， 二扩，一扩转移500μl菌液到20ml LB培养基中摇荡培养约为1h，至OD值约为0.5~1.0为佳，同时扩上5瓶，保证足够的融合蛋白以备后续实验。 诱导，加入200μl的IPTG,至终浓度为1mM，28℃摇荡诱导培养7h。 取出1ml诱导菌液以及未诱导菌液进行SDS表达验证。 剩余菌液5000*g离心5min，去除培养基，加入5ml裂解缓冲液，混匀后5000*g离心5min,收集菌体，-80℃保存备用。 缓冲液的配制以及细胞的破碎 裂解缓冲液配方：50mmol/L Tris-Hcl pH 7.5, 150mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA 用时加入 0.3mmol/L DTT, 0.1% NP-40 蛋白酶抑制剂。 细胞裂解之前最好先加入裂解缓冲液（1:10，v/v）,冰浴30min. 冰上超声波细胞破碎程序： 5s, 9s, 4min 离心15min,收集上清液，冰上备用。 融合诱饵蛋白的亲和挂柱 Glutathione Sepharose4B 珠子的准备： 取出一个干净的层析柱，用剪了头的移液器吸取1ml摇匀了的Glutathione Sepharose4B珠子于柱子中，加入4ml的裂解缓冲液，温和平衡珠子,4℃，1300*g离心30s，去除裂解缓冲液，重复至少5次。因为珠子的平衡程度与蛋白的亲和程度有着直接的关系。 诱饵蛋白与珠子的亲和结合： 将准备好的带GST标签的融合蛋白细胞裂解液加入到准备好的珠子中，冰上温和缓慢摇滚孵育1h，4℃，重力自然过柱，直至所有的细胞裂解液全部过柱。（控制在3h之内） 洗脱 4℃，1300*g 离心30s去除裂解液，再加入4ml裂解缓冲液温和摇滚数次，4℃，1300*g离心去除缓冲液，重复不少于5次，确保杂蛋白去除干净。 辣椒总蛋白的提取及定量分析 植物总蛋白提取缓冲液的配制： 50mM Tris-Cl pH 7.6 50mM NaCl 5mM MgCl 5mM EDTA 1mM DTT NP-40 0.5% Triton X-100 植物蛋白酶抑制剂 植物总蛋白的提取方法：从-80℃中取出辣椒叶片（青枯病处理与未处理，高温处理与未处理），用液氮迅速研磨碎辣椒材料，加入适量的PVPP及1ml提取缓冲液，研磨混匀并转移至10ml离心管中，再加入1ml提取缓冲液，把研钵中的剩余材料转移到离心管中，冰上备用。在每个离心管中加入一定量的蛋白酶抑制剂。 4℃,6000*g离心30min,收集上清液，去除组织残渣。 4℃，最大转速离心30min,收集上清液，冰上备用。 诱饵蛋白与靶蛋白的亲和结合 取出第二步获得的挂着诱饵蛋白的柱子，加入上一步所获得的植物总蛋白溶液，温和翻滚1h，重力自然过柱，直至所有的溶液全部过柱。总的结合反应不要超过5h。 4℃，1300*g 离心30s去除植物总蛋白溶液，再加入4ml植物总蛋白提取缓冲液，温和摇滚数次，4℃，1300*g离心去除缓冲液，重复不少于5次，确保杂蛋白去除干净。 靶蛋白的洗脱 洗脱缓冲液：50 mM Tris/HCl, pH 7.6 10 mM EDTA 1 mM DTT 5 mM MgCl2 500 mM NaCl 在柱子中加入1ml的洗脱缓冲液，温和摇滚数次，4℃，1300*g离心收集缓冲液，冰上备用，重复3次，将收集到的缓冲液集中在一个离心管中冰上备用。 靶蛋白的浓缩及定量分析 洗脱后蛋白的浓缩脱盐：将洗脱液分次加入到浓缩离心柱（3K）上,14,000*g离心10min，最后一次离心30min。 加入400ul低盐离子浓度缓冲液于柱子上，4℃，14,000*g离心10min, 重复3次。最后收集浓缩靶蛋白溶液。 分析蛋白溶液的浓度，采用考马斯亮蓝法（Bradford法）详情参考《HPR(羟基丙酮酸还原酶)酶活的测定以及DN-CaRop1和CA-CaRop1对HPR酶活的影响》。 SDS分析亲和差异 洗脱的靶蛋白浓缩溶液加入5*SDS上样缓冲液至终浓度为1-2*，混匀，沸水浴10min,离心上样。上样量约为30ul，顺序为： M,GST+对照、CA-GST+对照、CA-GST+青枯病处理 （12%凝胶） M,GST+对照、CA-GST+对照、CA-GST+青枯病处理 （7.5%凝胶） * 注意制胶前，清洗干净玻璃板，梳子等，确保除干净干扰杂