PCR的影響因素.docVIP

PCR的影响因素之一 PCR的影响因素之二 PCR主要影响PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。（一）温度循环参数。在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃ 60 s，37℃ 60 s，72℃ 120 s，共25～30个循环，扩增片段500 bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环 3 0～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。 PCR的影响因素之三 引物：在Tris缓冲液中，引物可以低温保存相当长的时间。除非有核酸酶的污染，引物 一般非常稳定。笔者使用过10年前的引物，仍然好用。问题的关键在于您的引物设计是否合理，使用过程是否规范。如果您怀疑引物有问题，可以选择重合。如果 重合后，还没有改善，请查其他原因。引