動物肝脏DNA的制备DNA的Tm值测定.docVIP

动物肝脏DNA的制备 、DNA的Tm值测定 Ⅰ 动物肝脏DNA的制备 一、目的 1．了解肝脏组织制备核酸DNA的方法； 2.弄清DNA制备的过程中，清除RNA和蛋白质的机理 。 二、原理 根据核糖蛋白（RNP）和脱氧核糖蛋白（DNP）在一定浓度电解溶液中溶解度不同，将二者分离。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，并释放出 DNA ，再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出，达到分离提纯DNA的目的。 在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNP溶解度大，而DNP的溶解度却很小；相反，在1 mol/L的氯化钠溶液中， DNP的溶解度却很大，从而使二者获得了分离。核蛋白分离后可用蛋白质变性沉淀剂（氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠和热酚）去除蛋白质，释放出的DNA用乙醇沉淀，析出核酸。 动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，因此在提取核酸时，尽量在低温下操作，并要加柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。防止Mg 2+、Fe 2+及Co 2+等激活剂，以便降低核酸酶对核酸的水解作用。 三、操作 1抽提 取新鲜鸡肝2g，用SC液洗去血液，低温剪碎（在预冷的研钵中操作），加入4ml SC缓冲液, 用玻璃匀浆器匀浆，然后离心(4000r/min)10min,倾出上层RNP层溶液 。向下层溶液中再加入4ml SC缓冲液，震荡混匀后再4000r/min离心10分钟。倒掉上层溶液。 2分离 将下层沉淀用10ml SC液冲洗并转入50ml三角锥形瓶中混匀后，加入2ml 5% SDS溶液，混匀，再加入7.5ml 氯仿/异戊醇，边振动边加入1.15gNaCL晶体，充分混匀后振荡30min，然后转入到50ml离心管，于4000r/min离心20min。小心用吸管由上至下吸取上层DNA层溶液于干净小烧杯中。 蛋白质层 蛋白质层 氯仿层 水相 3．提纯 加入2倍DNA溶液体积的95%的乙醇，边加入边用玻璃棒沿同个方向缓慢搅动，当成纤维状DNA全部绕在玻璃棒取出，再用95%乙醇2ml冲洗干净，再用5%氨水将其溶解。并用蒸馏水定容到5ml。即为样品溶液。 待测样品编号，放置在冰箱中。 四、思考题 1、在核酸提取溶液中，当加入一定浓度SDS、异戊醇和氯仿后，得到三层溶液分别含有哪些主要物质，为什么？ 2、SC缓冲液的组成分是什么，该溶液在制备核酸时有何作用，能否用磷酸盐缓冲液代替？ 3、如何用紫外法判断DNA样品的纯度？ Ⅱ 酵母RNA的提取 一、目的 1．了解用浓盐法提纯RNA的基本原理和方法。 二、原理 酵母中RNA含量可占干重3-10%，DNA含量很少。因此采用酵母作为制备RNA的原材料。 适宜于RNA制备的方法有稀碱法、浓盐法和苯酚法。前者是用1%NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸中和。本实验采用浓盐法提取RNA，其机理是用10%NaCL溶液改变细胞膜的通透性，使核酸从细胞内释放出来，然后升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，除去菌体，再调至pH 2.5 (RNA的等电点)，使RNA沉淀出来。 三、操作 1、提取 称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加10% NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴中提取半小时。 2.分离 将上述提取液取出，用自来水冷却，分装在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。 3.沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50mL烧杯内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的pH逐步下降，溶液中白色沉淀也逐渐增加，当 pH=2.5（RNA 等电点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。 冼涤、溶解 将RNA沉淀液离心（3000r/min）5min，去上清，收集沉淀，加入3mL 0.5mol/L碳酸氢钠溶液溶解沉淀（ 用玻捧缓慢搅拌沉淀，以助溶解，如有不溶物则为杂质，再离心去除之）。得到RNA制品溶液，供测定之用。如需要进一步纯化时，可在冷却下，加入两倍冷乙醇进行沉淀。 将沉淀物置10ml量筒里，用少量蒸馏水将沉淀物调成糊状，经充分膨胀后，再加少量蒸馏水稀释，然后用6%氨水调pH至7.0，并暂且定容到5ml，测定稀释50倍后的A260应控制在0.6-1.0之间 ，根据该测定值再次调节待测样品的体积，作为待测样品。 待测样品编号，放置在冰箱中。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 温度（℃） 37 50 60 70 75 80 85 90 95 100 100-50 100-37 保温15min A260nm 0.487 0.5 0.504 0.51 0.514 0.544 0.578 0.596 0.612