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硕士研究生实验报告 实验名称： 免疫印迹与沉淀 姓 名： 何沙 学 号： 20091902092 学 院： 生物工程学院 专 业： 细胞/组织工程与生物材料 成 绩： 任课老师 (签名)： 日 期： 2010.07.02 《 专业实验 》实验报告 开课实验室： 生物工程学院315 日期：2010-06-25 学院 生物学院 年级、专业 2009细胞/组织工程与生物材料 姓名 何沙 成绩 课程 名称 专业实验 专业实验 名 称 免疫印迹与沉淀 指导教师 教师评语 教师签名： 年 月 日 一、实验目的 1、理解熟悉western blot实验原理及方法； 2、熟悉操作western blot的实验操作步骤； 3、对两种样品蛋白质的表达丰度进行比较，并得出结论。 二、实验原理 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。1）转膜液： Tris-base 5.8g，甘氨酸 2.9g， 10%SDS 3.8ml，甲醇200ml，双蒸水定容到1000ml （2）TBST：含20%吐温-20的TBS缓冲液 （3）封闭液：5%脱脂奶粉（TBST） 材料：PVDF膜Gel name : 2010-06-25 19hr 50min (Raw 1-D Image) Index Name Volume Adj. Vol. % Adj. Vol. Mean Value Density OD*mm2 OD*mm2 OD OD/mm2 1 U1 16.8830738514 16.8830738514 40.5124890757 1.4368601311 356.3420024424 2 U2 24.7906772228 24.7906772228 59.4875109243 1.5977390476 396.2400509854 R-Squared = 0.000000 Unable to calculate regression: Too few data points 表达丰度之比=U2/U1= 396.2400509854/356.3420024424=1.112 六 实验总结 实验结论： （1）成功的将两种样品蛋白质转移到膜上，并利用抗体进行检测。 （2）大分子蛋白质U2中的β-actin的丰度是小分子蛋白质U1中β-actin的1.112倍。 注意事项： 1.用于 Western blot和免疫沉淀的抗体最好不同，否则将出现很多非特异性条带。 2. Western blot中，转移在膜上的蛋白处于变性状态，其空间结构被改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于Western blot检测。这种情况下，可将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用抗体进行免疫沉淀，得到的生物素化的目的蛋白可用酶标记亲和素进行Western blot检测。 3.化学发光法检测的敏感度很高，实验中取胶和膜必须带一次性手套。 4. 曝光、显影和定影需在暗室中进行，X光片用完后一定要收好，避免曝光 1