生化技术：7亲和层析素材.pptVIP

第三节 提高吸附剂的操作容量 影响吸附剂操作容量的因素 ①配体的性质 ②配体在吸附剂中的含量 ③配体与吸附物结合时的位阻效应大小 ④基质的多孔性 ⑤操作条件 一、在配体和基质间引入“手臂” 1.原理 在配体和基质间引入“手臂”，使配体离开基质的骨架，减小基质的立体（空间）位阻效应，增加配体的活动度和伸入溶液的深度，提高吸附剂的操作容量（特别使用于小分子配体） 例 用对氨基苯硫代吡喃作为配体，Sepharose4B为基质纯化β-半乳糖苷酶时，如果将配体直接连接在基质上，则不能吸附β-半乳糖苷酶，而当在基质和配体之间引入3,3’-二氨基二丙胺琥珀酰胺手臂时，则可有效吸附β-半乳糖苷酶 注意：并非手臂越长越好，因为太长可能折叠弯曲，反而降低吸附容量 2.吸附剂衍生物的制备 ①琼脂糖活化 ②将氨基化合物（如1,6-己二胺;6-氨基己酸等）共价结合于活化的琼脂糖上制成稳定的琼脂糖衍生物 ③在碳二亚胺存在下，基质通过手臂与含羧基或氨基的任何化合物结合成固相载体 ④将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反应后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生成一系列具有不同长度“手臂”的亲和吸附剂 * * * * * 第 七 章 亲 和 层 析 物质分离纯化的依据 利用各分离物质理化特性的差异性 但由于分离方法的特异性不强，导致分离纯化的收得率较低；为了解决这一问题，一种有效的分离方法应运而生——亲和层析 亲和层析的概念 利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法 第一节 基 本 原 理 一、基本原理 1.亲和层析载体的组成 配体L以共价键结合到活化的基质M上，构成固相载体 2.原 理 首先待分离物质S借助静电引力、范得华力及结构互补效应等作用吸附于固相载体上，与其它物质分离；然后通过改变起始缓冲液的pH值，或增加离子强度，或加竞争性抑制剂等方法使待分离物从固相载体上脱离下来 二、分 类 特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异性强，结合力大 通用性配体亲和层析：配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者 三、特 点 优点：上样量大，分辨率高，操作步骤少，被分离物质的活性不易丧失 缺点：每分离一种物质都必须找到合适的配体，并将其制备成固相载体 第 二 节 操 作 一、基质的选择 一种理想的亲和层析基质应满足的条件 特异性强（非特异性吸附少） 高度的亲水性 性质稳定 具有大量容易被活化的基团，且容易与配体结合 适当的孔径和筛孔数目 常用亲和吸附剂采用的基质 一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。 商品纤维素：具有非特异吸附性，且本身结构不均一 聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后，多孔性会大大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之间引入间隔物 玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也有一定的吸附力 目前使用最广泛的是Sepharose 4B，它是有D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量较大 二、配体的选择 通常可供选择的配体有抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体及其他物质（如凝集素、polyA、polyU、染料和金属等）等 1.与被纯化物质有适宜的亲和力 一般来说，配体对大分子物质的亲合力越高，在亲和层析时，分辨率就越好，应用价值就越高；但若配体与待纯化物质（生物大分子物质）之间的亲合力太大时，对分离纯化是不利的 如：用抗生物素蛋白（亦称亲和素）作为配体纯化含生物素的羧化酶时，由于抗生物素蛋白-生物素解离常数接近1×10-15mol，要其分离，必须在6mol/L盐酸胍溶液， pH1.5的剧烈条件下才能使羧化酶释放出来，而在此条件下，羧化酶的活性大部分已发生不可逆性丧失 2.具有与基质共价结合的基团 该基团和基质结合后，对配体与待纯化物质的亲合力没有影响或影响不明显 三、亲和吸附剂的制备 偶联方法 物理方法 包埋法和吸附法等 化学方法 偶联法：利用CNBr、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜、亚胺二烯酸等化学试剂使配体与活化的基质偶联或形成螯合物 交联法：即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试剂交联基质与配体 CNBr是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤 1.活 化 将一定量的贮存基质用布氏漏斗抽干，