枯草芽孢桿菌营养缺陷型突变株的筛选.docVIP

题目：细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定 一、实验原理：筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用亚硝酸钠为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。 二、实验器材：离心机，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；接种针，三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，枪头 三、菌种：大肠杆菌 四、所有用到的培养基：（分别列出配方） 1. LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min 2. 基本培养基： 葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水 100 mL，pH 7.2，110℃灭菌 20 min。 配固体培养基时需加 2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯，使用的器皿 需用蒸馏水或重蒸水冲洗 2~3 次。 3. 无N基本液体培养基： K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min 4. 2N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min 5. 完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加 2%的琼脂。 6. 补充培养基(简称SM)：为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某—种或几种营养成分的培养基称补充培养基。 7.醋酸缓冲液(pH4.5)（ 取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml）、 0.1 mol/L亚硝酸钠溶液(68.995×0.1=6.8995g/L)、0.07 mol/L酸氢二钠溶液(pH8.6)(141.96×0.07=9.9372g/L) 五、实验步骤 1th day: 各种所需培养基、试剂的配制及所需器材灭菌 2th day：菌体活化与培养：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜，14~16h. 3th day：早上添加5mlLB液，充分混匀后，分装到两只三角瓶，继续培养5小时。将两瓶菌液分别倒入离心管中，离心（3500rpm）10分钟，弃上清，其中一管加生理盐水5ml，打匀沉淀，然后倒入另一离心管中，两管合并成一管。（菌体密度控制在 10*7~10*8个/mL）。LB液体10ml、生理盐水、两个100ml三角瓶、5ml离心管*2、 LB液体10ml、生理盐水、两个100ml三角瓶、5ml离心管*2、 菌液浓度测定比浊计数法（OD600=1,枯草芽孢杆菌浓度为6×10*个/mL）。 亚硝酸钠(NIT)诱变:取菌悬液1mL、醋酸缓冲液(pH4.5) 2 mL、0.1 mol/L亚硝酸钠溶液1 mL,于26摄氏度下保温25 min后每个样中,加入0.07 mol/L磷酸氢二钠溶液(pH8.6)20 mL,以终止反应。然后取诱变菌液 1 mL 稀释涂布于LB琼脂平板上，在 30 ℃下培养 48 h 后进行菌落计数，计算致死率.无菌水20ml、平皿15个、300mlLB固体、10ml移液管、醋酸缓冲液(pH4.5) 无菌水20ml、平皿15个、300mlLB固体、10ml移液管、醋酸缓冲液(pH4.5) （三）营养缺陷型浓缩（淘汰野生型） 3th day： 延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，10ml无N、100ml 三角瓶、枪头、5ml离心管37℃培养12h。4th day： 10ml无N、100ml 三角瓶、枪头、5ml离心管 初筛：加入等体积2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul(1 国际单位（IU） = 0.60μg 结晶青霉素G钠盐 ＝ 0.625μg 结晶青霉素G钾盐 )，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml(青霉素母液过滤除菌后加入），再放入37℃培养。2N基本培养液10ml、5万U/ml青霉素钠盐溶液 2N基本培养液10ml、5万U/ml青霉素钠盐溶液 （四）营养缺陷型检出 5th day：从培养12、16、22小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。 7th