枯草芽孢桿菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究.docVIP

枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶条件的研究 摘 要： 利用单因素法对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基成分进行优化，确定发酵培养基各成分最适宜配比。最后确定了该菌株的最适发酵培养基配方为(g/ 100 mL) :棉籽饼粉3.0 ,酵母浸粉1.75 ,麦芽糊精10 ,柠檬酸钠0.13 ,CaCl2 0.13 。K2HPO4 1.0 ;最适摇瓶发酵条件为:接种量2 % ,装液量50 mL/ 250 mL ,摇床转速200 r/ min ,34 ℃,发酵54 h ,碱性蛋白酶的发酵单位可达1648.8u/ mL。此外,还进行了5 L 罐放大实验,在5 L 罐所确定的最适工艺条件下,发酵单位可达 520.2 u/ mL 。 关键词： 碱性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；发酵；培养基 引 言　 碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,主要应用于生产加酶洗涤[1] ,另外,在制革、丝绸、医药、食品、饲料和生物化学试剂等领域也有应用。我国在20 世纪70 年代初期就成功开发了碱性蛋白酶,并实现了工业化生产[2] 。目前,我国用于生产的菌种为国内学者自行筛选诱变的菌株———枯草芽孢杆菌,其发酵单位在10 000 u/ mL ,与国外先进水平相差甚远[3]。本实验所采用的产碱性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌,其实验发酵单位为22 000 u/ mL,与国外大型酶制剂公司所报道的生产水平30 000 u/ mL 相差较大[4]。本实验对该菌株的发酵培养基利用单因素实验确定其基本成分，选择出适合该菌株发酵的最适培养基，从而使其酶活有一定的增长,为其工业化生产奠定基础。 1 　材料与方法 1.1 　菌　株 枯草芽孢杆菌(Baci11us subti1is) 。 1.2 　试剂及仪器 酪氨酸、福林酚试剂、三氯乙酸、无水碳酸钠、干酪素; 棉籽饼粉;酵母浸粉;麦芽糊精;柠檬酸钠;CaCl2 ;K2HPO4;KCl由实验室提供。pH计、722 分光光度计、恒温水浴锅、离心机。 1.3 培养基 种子培养基(g/L)：胰蛋白胨 5、葡萄糖 10、酵母浸粉 5、K2HPO4 18, pH 值自然，105℃蒸气灭菌20min； 摇瓶培养基（g/L）：酵母浸粉 0.875、麦芽糊精 5、柠檬酸钠 0.15、KCl 0.46、CaCl2 0.15、K2HPO4 0.5，pH 值自然，105℃蒸气灭菌20min。 发酵培养基(g/L)：酵母浸粉 5、葡萄糖 5、麦芽糊精 15、柠檬酸钠 5、KCl 8.5、CaCl2 5、K2HPO4 3.5，pH 值自然，105℃蒸气灭菌20min。 1.4 方 法 1.4.1 碱性蛋白酶活力的测定 取发酵液于4000r/min 离心20min 取上清液，采用Folin 酚法测定蛋白酶活力[5]。 酶活力单位定义为：在温度55℃ pH10.0 条件下，1min 水解酪素产生1μg 酪氨酸所需酶量定义为1 个酶活力单位，以U 表示。 A680*K*n*4 样品的酶活力(U/ml)＝——————————— 10 式中：A-- 样品平行实验的平均吸光度 K--吸光常数 4 --反应试剂的总体积(ml) 10 --反应时间(min ) n --稀释倍数 1.4.2 不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶的影响 无机盐分别选用0.02% Na2HPO4、0.02% KCl、0.02% K2HPO4、0.02% NaCl，以不加无机盐为对照组，在其他条件不变的情况下，以酶活力为指标，确定最佳无机盐。 2 结果与分析 2.1 碱性蛋白酶酶活力测定标准曲线 碱性蛋白酶测定结果如图1 所示。由该曲线求得线性回归方程为：Y=89.317X-2.048，R2=0.9935。本法在酪氨酸浓度0～60μg/ml 范围内有良好的线性关系。 2.2 不同无机盐对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶粗酶酶活力的影响 由图2 分析：K2HPO4与Na2HPO4相比较， HPO4~一定时，Na比K对芽孢杆菌产酶较好。K2HPO4与KCl相比较，K一定时，HPO4~比Cl~对芽孢杆菌产酶有促进作用。KCl与无CaCl2相比较，对芽孢杆菌产酶无影响。所述，KCl有利于芽孢杆菌产碱性蛋白酶。 2.3　5L 罐发酵过程曲线 在摇瓶实验基础上,进行了5 L 罐中的放大实验。装料系数: 017 , 接种量: 4 % , 温度:30 ℃,转速:300 r/ min。对发酵过程中的菌体PH、粗酶液中酶活力及发酵液中OD600进行了测定,所绘发酵曲线如图3 所示。5 L罐发酵单位最高可达520.2 u/ mL 。 图3 发酵罐过程曲线