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枸杞多糖的提取与鉴定 1242818杨立君 实验原理 强酸可以使糖类脱水生成糠醛。生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。颜色的深浅可以作为定量的标准。这一方法具有很高的灵敏度，糖含量在30μg左右就能进行测定，所以可以作为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。 实验试剂 1.标准葡萄糖试剂：将葡萄糖105℃烘干至恒重（2h），准确称取50mg,无离子水定容至500mL,终浓度为0.1mg/mL. 2.蒽酮-浓硫酸试剂：称取0.1997g蒽酮，溶于100mL浓硫酸，现用现配。 3.葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖 4.硫代硫酸钠溶液，活性炭，正丁醇，无水乙醇，丙酮。三氯甲烷，甲苯胺乙醇溶液 实验器材 分光光度计，超速离心机，电炉，烧杯，试管，干燥器，滤纸，层析缸以及其他相关玻璃仪器 实验流程 (一) 提取 枸杞干果粉碎，氯仿- 甲醇（2∶1）回流脱脂8~10 h 近无色，挥干溶剂以后将脱脂后的枸杞样品放入烧杯中，分3次加15、12、10 倍量的蒸馏水于90 ℃水浴提取，每次2 h；收集3 次的滤液减压浓缩至约200 mL，转移到大烧杯中，加4 倍量的95%乙醇，沉淀12 h 后抽滤，并依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，干燥后便得到枸杞多糖的粗制品。 （二）纯化 多糖粗品加水溶解，4 000 r/min 离心10 min 后取上清液，加30%双氧水适量，40 ℃保温4～6 h 后，加三氯甲烷-正丁醇（4∶1，Sevag 法）溶液沉淀蛋白，取上清液；此步骤反复多次，直到无白色絮状沉淀出现。将除去蛋白的多糖溶液浓缩后，转移到分子排阻为8 000～10 000 Da 的透析袋中，流水透析24 h 后，蒸馏水透析过夜，溶液颜色变淡，浓缩后 真空干燥得枸杞多糖精制品。 (三) 理化性质分析 将枸杞多糖精品分别加入水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇中，观察其溶解性。另在浓硫酸存在下观察枸杞多糖与α-萘酚的作用，于界面处观察颜色变化。 （四）蒽酮比色法测定含量 制备标准曲线：取六只试管，如下表进行操作： 管号 步骤 0 1 2 3 4 5 标准溶液，ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水,ml 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 置冰浴5min 蒽酮试剂,ml 4 4 4 4 4 4 沸水浴中准确煮沸10min,自来水冷却,室温放置10min后,比色 A620 2. 样品含量测定 吸取1ml多糖溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出后自来水冷却，620nm比色，其他条件与做标准曲线相同。测得吸光度值由标准曲线查处出样品液的糖含量。（如果样品管的吸光度值超出标准曲线范围，需将样品进行适当的稀释，再取1mL进行鉴定）。 3,计算 根据所测的吸光度平均值，根据标准曲线，求得糖含量（微克），记为 式中表示1mL样品测定液的多糖含量（μg）;表示多糖提取液的体积（mL）;n表示测定液的稀释倍数；m表示枸杞的质量。 (五) 枸杞多糖及单糖鉴定纸层析 1. 以正丙醇-浓氨水-水为展开剂，分别将枸杞多糖粗品和精品溶于水中，点样于层析滤纸上，展层后吹干，以甲苯胺乙醇溶液染色，乙醇漂洗。 2. 将层析滤纸剪成纸条，将多糖样品水解液点样，近旁点已知组分的标准混合液。滤纸条悬挂于层析缸中层析，纸条在显色剂中浸泡一下，悬于空气中，用NaOH-乙醇液喷雾于滤纸上至完全润浸并显出色斑，干燥，浸入硫代硫酸钠溶液中定影。与已知组分的标准单糖混合物所显的色斑对比，就可鉴定多糖样品中单糖的成分。 参考文献 [1]侯新东，盛桂莲，葛台明，李继红.生物化学实验指导书[M].武汉：中国地质大学出版社有限责任公司,2011年12月第一版 [2]苟春林，苟金萍，张艳，王晓菁，姜瑞.枸杞多糖的提取分离及其组成研究[J],宁夏农林科技，2012，53（05）：89-90，92 [3]武金霞.生物化学实验教程[M],北京：科学出版社，2012年8月第一版 [4]刘军海, 任惠兰, 李风风, 李广录.响应面分析法优化枸杞多糖提取工艺条件[J],时珍国医国药2008年第19卷第4期 Data Analysis t/min 17 22 24 35 45 55 85 10.060 10.020 10.010 9.930 9.870 9.785 9.565 12.91 12.87 12.86 12.78 12.72 12.64 12.42 2.558 2.555 2.554 2.548 2.543 2.537 2.519 由图可知，反应的级数是一级. 半衰期：t=ln2/k=12