核酸的提取與纯化.docVIP

核酸的提取与纯化DNA的提取与纯化 主要原理 存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎，暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时通过蛋白酶的，使DNA与蛋白质进行分离，利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去除蛋白质，从而提取高纯度DNA。 蛋白质K（mg/ml）液（mmol/l Tris(pH 8.0),500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS）,硅胶柱，TE（mmol/l Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tris-乙酸，mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，%溴酚蓝，pH 7.0) 实验方法 提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的。其中：氯仿抽提法由于具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,者较少。而的操作比较简单，且毒性很低，对的影响故而广大实验者所使用的生产厂家较多沉淀方法多见，主要如下。 1 处理 ：提前准备。 ，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，。用洗。 的，加入蛋白液K终浓度达到ug/ml，~6小时。 提前准备。 mg动物组织切碎，置于一无菌的ml离心管中（，尽量越碎越好） 加入150~200ul的裂解液ug/ml的蛋白酶K）直至完全，（鼠尾~8h,可以过夜裂解，每颠倒~3次） 如果需要去除RNA，可以加入适量Rnase A样品中，室温孵育min。 r离心min，转移上清于无菌的离心管。 DNA提取过程 无水乙醇和的DNA（DNA，不能弃去） 加入硅胶柱中，r离心1min，%的清洗杂质，洗~3次。 硅胶吸附柱置于干净的离心管中，中央加入ul预热TE（）或去离子水（）室温静置min，r离心1min，洗脱ＤＮＡ。洗脱ＤＮＡ置于－２０。 　　　凝胶电泳 ）%琼脂糖配制：例如：g琼脂糖+15ml 0.5*TAE微波炉加热至沸腾，待降低至Gold view染料（ug/100ml）倒入小型胶槽中（规模按此比例配制）min。 ）~100ng DNA,用去离子水补充体积至ul，加入ul 10*DNA loading Buffer，进行V 20~30 min（电泳液 5*TAE）　 ） 1 裂解液与样品的比例要适当，过少的裂解液可能导致样本裂解不完全，而过多的裂解液也会效果。 2 ，免影响；完全裂解后可以呈粘稠状。 3 -80℃冰箱或液氮中，且避免反复；枪头，避免ＤＮＡ酶污染。 RNA的提取与纯化 RNA的提取方法有很多种，其中Trizol提取RNA是目前常用的方法之一。Trizol苯酚和异硫氰酸胍配制而成，在匀浆和裂解过程中，Trizol裂解细胞、降解成分，但同时保护RNA，RNA酶活性。在抽提后，RNA存留在水相中，用异丙醇最后得到RNA。 Trizol，氯仿，DEPC水DEPC水配制%乙醇，*MOPS缓冲液mol/L MOPS,80mmol/l NaAc,10mmol/l EDTA Na2）*MOPS 150ml,37%甲醛80ml,加水至1500ml）（%甘油，mmol/l EDTA,0.25%溴酚蓝，%二甲苯青） 实验步骤 1 RNA的提取 ）cm*25cm培养瓶细胞+1mlTrizol）ml组织+1mlTrizol（超声破碎仪破碎细胞使之充分裂解）注：加mlTrizol。 （2）转入5mlEP管，加ml氯仿。 ）至氯仿完全混匀，室温~3min（，上层为清，下层为红色） （4）：r,10min. (5) 转上层水到EP管，尽量避免吸取中层蛋白质层。注上层为RNA；中层为蛋白；下层为DNA。 ）0~500ul),充分混匀，冰浴min。注如果组织，RNA提取的量，可以将异丙醇-20 （7）：r,15min. (8)弃上清，管底可见白色沉淀，即为RNA。 ）ml75%乙醇（水配制）离心：r,5min。 （10），加ml 75%乙醇（实验要求省略） （11）r,5min,弃上清。 短暂离心min，吸出残留乙醇，室温晾干min（~25℃） （13）~40ul DEPC水，立即用于逆转录或置于%乙醇中保存于-80。 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 %甲醛变性琼脂糖凝胶（ml） g 无Rnase水 17.4ml 10*MOPS 2.0ml 37%甲醛 将琼脂糖加热融化后，加*MOPS，待胶冷却至，加入甲醛入胶板5℃ 5min，冰上骤冷，加入~1.0ul的溴化乙锭（mg/ml）%甲醛变性胶*甲醛变性胶电泳缓冲液中电泳min。RNA样品在~10V/cm的电压电泳min。 1 动物组织需在-80液氮保存，且在实验过程中避免冻融。 2 液体的每一步都必须充