睡眠剝夺对小白鼠免疫能力的影响.docVIP

PAGE 6 - 睡眠剥夺对小白鼠免疫能力的影响 主讲人：辛凯悦 指导老师：朱艳媚 班级:11级临床2班 组员：杜晨阳、辛凯悦、朱灵凤、舒文静、李毅 一．研究目的 睡眠是一种生理现象，睡眠充足与否与人体健康有着密切联系。长期睡眠剥夺可引起人或动物产生不良情绪反应、免疫功能下降等等。随着生活节奏的加快，越来越多的儿童与成年面临睡眠不足的危害，这已足够引起人们的注意。本小组通过一种慢性不完全剥夺小鼠睡眠实验来观察睡眠不足对小鼠免疫功能的影响。 二．研究对象 一组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机分成a组、b组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。 二组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机分成c组、d组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。 三组：健康雄性小鼠20只，体重22±2g,随机分成e组、f组，即正常对照组和慢性不完全睡眠剥夺组。 三．实验方法 （一）动物模型的建立 采用轻触法一、二组对小鼠不完全剥夺睡眠，每天剥夺睡眠时间从上午六点到下午五点结束。其中a组、c组是实验组，b组、d组是对照组。具体方法为：当实验组小鼠出现睡眠状姿势时，即用毛笔轻触小鼠使其保持清醒状态，当小鼠处于清醒状态时则不对其进行任何刺激，在睡眠剥夺过程中，正常对照组始终可以自由睡眠。一个周睡眠剥夺后，进行免疫功能的测定。 （二）免疫功能的测定 1.胸腺指数和脾脏指数的测定 器材：滤纸，粗剪刀，婴儿称 对象：第一组实验小鼠 实验步骤： （1）用颈椎脱臼法处死第一组小鼠并立即称取体液 （2）解剖摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重（ HYPERLINK /Mg_47189/ \o 医学百科：mg mg） （3）所得重量分别除以小鼠体重(g)，再乘以100％，即分别得到胸腺指数和脾脏指数。??? 　　　胸腺指数=（胸腺重量/小鼠体重）×10　　　??? 脾脏指数=（脾脏重量/小鼠体重）×10 组别 动物数量(n) 胸腺指数(%) 脾脏指数(%) 正常对照组（b组） 10只 睡眠剥夺组(a组) 10只 补充: 统计学方法 所有数据均用均数± 标准差表示，各组均数间的差异显著性用t检验判断。P0.05表示差异具有显著性；p0.01表示差异非常显著；p0.001表示差异极显著；p0.05表示差异不具有显著性。 2.外周血T淋巴细胞亚群检测 器材：流式细胞仪 对象：第二组实验小鼠 实验步骤： （1）两组小鼠分别自眼底静脉丛取血，肝素抗凝。吸取抗凝全血100μL，加入预先调制好的FITC-CD3\PE-CD4\PE-Cy5-CD8 3种荧光标记抗体混合液12μL，并设置荧光同型对照。室温避光反应20min,然后加入红细胞溶解液，每份标本加1ml，混匀，室温避光10min,见细胞悬液呈亮红色时，说明红细胞被裂解，再加入含20mL/LFCS的生理盐水，以400g离心洗涤细胞2次，洗涤后的细胞最终回复到500μL。 （2）将两组液体移入流式专用管，上流式细胞仪检测。 3.红血球凝集实验 器材：96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL定量移液器，滴头，微型振荡器。 药品：流感疫苗，鸡血红细胞 对象：第三组实验小鼠 实验步骤： （1）用流感疫苗对两组小鼠进行免疫，一定的时间后抽取小鼠血液制成血清滴在反应板上。 （2）静置10min用流感病毒进行滴加，观察鸡血红细胞凝集情况并记录。 补充: (1)0.5%红细胞制备方法 　　先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1/5)，从鸡静脉采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5%鸡血红细胞悬液。 (2) 96孔微量反应板的清洗 将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。 四．预期结果 1.胸腺指数和脾脏指数的测定 经过一段时间的慢性不完全睡眠剥夺会对机体免疫功能产生伤害，胸腺和脾脏均会受到损害，表现为胸腺指数和脾脏指数分别下降。 2. 外周血T淋巴细胞亚群检测 睡眠剥夺以后的小鼠体内的T细胞总数将减少。经过慢性不完全剥夺睡眠的小鼠CD4、CD8T细胞数量应该会有所下降，导致CD4/CD8比值也会发生变化。 3.红血球凝集实验 对照组小鼠体内产生较多的抗体，可以与加入的流感病毒反应而抑制鸡血红细胞的凝集作用，所以红细胞不凝集，在反应板的微孔中红细胞应该沉底呈点状；而实验组经过睡眠剥夺的小鼠免疫能力会下降，产生的流感病毒抗体减少，流感病毒与鸡血红细胞产生凝集作用要强于对照组，红细胞凝集，预期现象是在反应板的微孔中平铺呈网状。 五.讨论