分子生物学讨论课.pptxVIP

分子生物学第二次讨论苏颖慧 2201150918刘祎阳 2201150919李 磊 2201150920周 泽 22011509271Western Blot的原理、方法及应用目录2蛋白质双向电泳的原理、方法及应用3DNA测序的原理与发展4DNA测序在医学中的应用①Western Blot的原理、方法及应用Western Blot的原理1.什么是Western blot◎印迹法（blotting）：是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。◎蛋白免疫印迹( Western Blot) ：是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。◎细胞内基因表达的最终产物是蛋白质，因此检测蛋白质是研究基因表达最常用、最有效的手段之一。Western Blot的原理2.基本原理 经过PAEG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blot的原理VS 标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。间接法直接法Western Blot的操作流程样品制备电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色Western Blot的操作流程1.水溶液提取法2.有机溶剂提取法3.层析或电洗脱法蛋白质样品制备聚丙烯酰胺凝胶电泳：（1） 清洗玻璃板 （2） 灌胶与上样 （3） 电泳 （4） 转膜缓冲液中浸泡凝胶电泳1.膜的选择：硝酸纤维素膜（CN）2.操作方法：半干法转膜Western Blot的操作流程半干型电泳转移槽?依次在电泳转移槽正极板上铺两 层正极缓冲液Ⅰ湿滤纸，一层正极缓冲液Ⅱ湿滤纸，膜，凝胶，三层负极缓冲液湿滤纸。?在膜上做好标记以便定位，并驱逐每层间的气泡。?盖上负极板，接通电源，进行转移。Western Blot的操作流程1.目的：降低抗体与膜的非特异性结合2.漂洗：去离子水与PBST或TTBS3.封闭：浸没于封闭液中，4摄氏度缓慢摇荡过夜封闭1.鼠抗人按1:1000比例稀释于20ml抗体稀释液中。2.加于膜上，室温下1-2h。3.漂洗：洗去游离的一抗一抗杂交 1.根据一抗来源选择合适的二抗（生物素连接的羊抗鼠），室温下一小时。2.漂洗：洗去游离的二抗二抗杂交Western Blot的操作流程底物显色原理： 辣根过氧化物酶在碱性条件下催化Luminol氧化，同时释放出光子，产生的光信号可用X射线片直接记录下来。加入Avidin（抗生物素蛋白）-生物素化辣根过氧化物酶（HRP）30-60min洗去游离的HRP用ECL化学发光剂进行信号检测Western Blot的操作流程Western Blot的应用1.目的蛋白的表达特性分析2.目的蛋白与其他蛋白的互相作用3.目的蛋白的组织定位4.目的蛋白的表达量分析1.Western Blot法诊断囊虫病2.应用荧光定量PCR和Western Blot 检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平4. Western Blot法测定风疹病毒特异性抗原Western Blot的应用1.Western Blot法诊断囊虫病囊虫病是由猪带绦虫幼虫即囊尾蚴寄生于人体引起的人兽共患寄生虫病Western Blot的应用1.Western Blot法诊断囊虫病免疫学实验对本病诊断有重要作用，但目前用各种方法纯化的抗原其敏感性、特异性均不理想。运用DNA重组技术，构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库，以囊虫病患者及病猪血清为抗体，从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）。这些抗原克隆经IPTG诱导，形成β-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白。采用简化Western blot法，以等比混合的四种融合蛋白为抗原测囊虫病、华支睾吸虫病、包虫病患者血清中的相应抗体Western Blot的应用2.应用荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平Western印迹分析检测STAT3表达荧光定量PCR检测STAT3mRNA的表达Western Blot的应用3.Western Blot法测定风疹病毒特异性抗原风疹病毒能够引起先天感染。通过孕妇传播，致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹综合症，如：先天性心脏病、智力低下等能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质、