氧化应激损伤的生物化学诊断_培训课件.pptVIP

* α-生育酚于292nm有特异性光吸收 胡萝卜素于450nm有较大光吸收 2. HPLC-分光光度法 生物样品中α-生育酚及胡萝卜素可经过HPLC法较好地分离开来，通过检测不同波长下的光吸收值可测定样品中的它们的含量。 * HPLC分离样品中维生素E 维生素E在激发波长296nm下可发射340nm的荧光 根据测试对样品纯度要求选择不同的样品处理方法 3. HPLC-荧光分析法 HPLC法大大提高了分析的准确度，且能同时 分离和测定各种维生素E同系物。 缺点是仪器设备较昂贵，分析成本高, 不适 应于常规检测的要求。 【方法学评价】 * 1. 2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 脱氢抗坏血酸+DNPH 2，4-二硝基苯腙 硫脲及硫酸铜 H+ 520nm 本法测的是样品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸总量 如省去氧化步骤，样品稳定，则可测脱氢抗坏血酸含量 是分光光度法较为理想的方法之一 特异性不高，其他碳氢化合物可干扰，加入硫脲可增加DNPH反应的特异性。 【方法学评价】 (三) 维生素C的测定 * 2. 荧光分析法 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 脱氢抗坏血酸+邻苯二胺 脱氢抗坏血酸对-氮杂萘 测定在激发波长350nm，发射波长430nm的荧光 本法测定的是抗坏血酸与脱氢抗坏血酸的总量 * 3. 氧化酶法 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 抗坏血酸氧化酶 脱氢抗坏血酸+Fe3++2，4，6-三(2-吡啶基)-S-三嗪 生色物 593nm 优点是不必对生物样品进行过多的纯化处理，甚至不用脱蛋白 样品中的脱氢抗坏血酸须用其他方法测定 【方法学评价】 * 4. HPLC法 最好的方法，先层析法将样品中的成分分离，再用柱后检测器检测。 HPLC-紫外分光光度法 (2) HPLC-电化学检测法 是此类方法中最为简单的一种 最为理想的测定生物样品中抗坏血酸含量的方法 返回章目录 * （一）脂质过氧化标志物检测 （丙二醛、脂氢过氧化物） （二）蛋白质氧化损伤指标检测 （三）DNA/RNA损伤检测 五、氧化应激损伤的标志物检测 * 1. 丙二醛(MDA)的测定——TBA比色法 操作简便、重复性好，是最常见测定方法 本法的线性范围约在5.0～20mmol/L 本法回收率较低，约为60%～80% 本反应缺乏特异性，测定结果以MDA的相对含量表示 影响因素较多 【方法学评价】 过氧化脂质中的MDA与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色化合物，在532nm处有极大吸收峰。 （一）脂质过氧化标志物检测 * 灵敏度高，最低检出限0.16μmol/L 样品中的G、Ch、TG、Pr等均不干扰测定 操作较简便，结果准确，荧光稳定，不需特殊试剂， 经济方便。 【方法学评价】 MDA可充分与TBA形成荧光缩合物 荧光产物的最大激发波长为525nm 1. 丙二醛(MDA)的测定——TBA荧光法 * 快速简便，特异性很高和灵敏度较高。 易产生干扰，预先加入CAT除去体系中的H2O2，可防止测定过程引起的过氧化干扰。 2. 脂氢过氧化物(LOOH)的测定——SeGSHPx法 【方法学评价】 LOOH(H2O2)＋2GSH LOH(H2O)+H2O＋GSSG SeGSHPx GSSG+NADPH+H+ 2GSH+NADP+ GSH还原酶 * 测A580可反映LOOH量 LOOH＋Fe2+-二甲酚橙 Fe3+-二甲酚橙复合物(FOX) H+ 440nm有吸收峰 560～580nm有吸收峰 2. 脂氢过氧化物(LOOH)的测定——FOX法 2. 脂氢过氧化物(LOOH)的测定——亚甲基蓝法 测定A666可计算LOOH含量 LOOH＋亚甲基蓝衍生物 产物 血红素或肌球蛋白 666nm * （二）蛋白质氧化损伤指标检测 1. 蛋白质羰基化的测定 2,4-二硝基苯肼法：生成苯腙。经典方法 硼氢化钠法：硼氢化钠中3H掺入蛋白质中将羰基还原为醇，通过3H反应物的放射性强度测定蛋白质羰基含量 荧光素肼法：羰基与荧光素肼反应生成腙类化合物 荧光胺