T载体的克隆.doc

实验原理 重组质粒的构建 T质粒载体 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 细菌在0°C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。 一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。 器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。 试剂 T 载体，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water 操作步骤 PCR产物与T载体直接连接： （1） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14~16°C。 （2） 取4个灭菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整） 4ul 目的基因 1ul T载体 0.5ul T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul） 1ul 连接酶缓冲液10 x buffer 3.5 ul dd Water 总量10ul 体系 （3） 上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14°C干式恒温仪（或14°C水中）中保温过夜（12-16h）。 （4） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。 大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化 器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器 试剂 E. coli菌种，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water ，LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal。 步骤 （1） 在超净工作台中，将1ml大肠杆菌菌液加入100ml LB液态培养基（不含抗菌素），37℃摇床培养过夜。 （2） 取0.5ml上述菌液转接到含有50mL LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD590为0.35~0.4左右