分子生物学实验13级化生一班于喜来1308106030.doc

13级化生一班 于喜来 1308106030 实验1 PCR 基因扩增 实验目的 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。 实验原理 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2 n倍。 1．变性：加热使模板 DNA 在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链， 即变性阶段。 2．退火：使溶液温度降至 50-60℃，模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 3．延伸：溶液反应温度升至 72℃，耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，在引物的引导下。利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按 5′-3′ 方向复制出互补 DNA，即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸 3 个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30 个循环后DNA可扩增106-109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。 仪器、材料与试剂 (一) 仪器 PCR热循环仪 、琼脂糖凝胶电泳系统 (二) 材料DNA模板 、4种dNTP 、引物l、引物 2 、Taq酶 、琼脂糖 、DNA分子质量标准物、移液器、枪头、PCR管及管架 (三)试剂 5×TAE Buffer 实验步骤 1. 分别以提取的质粒为模板，以引物P1和2为引物，进行PCR扩增反应。 PCR反应体系如下（总体积为20 μl）： 无菌水 14 μl 2 mM dNTPs 2 μl 10×Taq buffer 2 μl Templet DNA(1mg/ml) 0.5 μl P1 F (25μM) 0.5 μl P2 R (25μM) 0.5 μl Taq酶 0.5 μl 总体积 20 μl 反应条件： 94 ℃预变性 5 min 94 ℃变性 55 ℃退火 30 sec 30 cycles 30 sec 72 ℃延伸 1min 20 sec 72 ℃补充延伸 8min 10 ℃ Forever 2．琼脂糖凝胶电泳分析 配制 1% 琼脂糖凝胶，取 5 μL 扩增产物电泳。保持电流140。电泳30分钟，结束后，紫外灯下观察结果。 思考题 本实验中有哪些因素可能对实验造成影响，导致实验失败或是非特异性扩增？ 答：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。 实验2 质粒DNA的提取与纯化 一、实验目的与原理 质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。 二、材料与试剂1、材料：大肠杆菌2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪3、试剂： 溶液I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)：10 mM EDTA(pH8.0)、50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存溶液II 0.2 M NaOH, 1%SDS ,1：1混合后现配现用溶液III 5 N KAc pH4.8高压灭菌，4℃保存 3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂 三、操作步骤 1、细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜2、2 ml/菌液离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液3、沉淀加入Solution I 250 ul，室温放置5 min5、加入300 ul Solution II, 轻柔的颠倒混匀，冰上放置3 min 6、加入250 ul Solution III，混匀，离心7 min，12000 rpm 7、吸取680 ul上清到层析柱中（