实验一底物浓度对酶活性的的影(带图片)3.docVIP

实验一 底物浓度对酶活性的影响 ——碱性磷酸酶米氏常数的测定 一、实验原理 ⒈ 在温度、PH和酶浓度一定时，底物浓度对酶活性（V）的影响，可用米氏方程表示为： V= 式中Vmax为最大反应速度，Km表示米氏常数，[S]表示底物浓度，当 V=Vmax时，Km＝[S]。 Km是酶的特征性常数，测定酶的Km值是研究酶性质的重要方法之一。大多数酶的Km值在0.01－100mM之间。对于不同的底物，酶有不同的Km值。 本实验以碱性磷酸酶为例，测定在不同底物浓度时酶活性的变化。然后再分别以 为横座标，以 为纵座标作图，从图上可以方便地求出碱性磷酸酶的Km值。 ⒉ 在本实验中，利用分光光度比色法测定酶的活性。碱性磷酸酶可作用于多种底物。当它作用于磷酸苯二钠时，释放出酚。酚在碱性溶液中与4－氨基安替比林作用，并经铁氰化钾氰化生成红色的醌类化合物，该化合物在510nm处有显著光吸收。与标准酚的溶液作对照或制作标准曲线，可计算出在不同底物浓度时酶的活性。 显色反应的原理如下： 二、试剂： ⒈ 酚贮存标准液：溶解（AR）酚1g于0.1mol/L盐酸中，用0.1mol/L盐酸稀释至1L。此酚溶液含量约为1mg/mL。须进行标定。标定方法见上海市医学化验所主编《临床生化检验》上册第十章，酚类测定。 ⒉ 酚应用标准液（0.1mg/mL）：使用前