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淋病奈瑟菌的分子生物学检验 目 录淋球菌概述淋病奈瑟菌的基因组结构特征淋病奈瑟菌核酸的检测淋病奈瑟菌的耐药性检测分子生物学检测的临床意义淋球菌淋球菌（gonococci)又名淋病奈瑟菌（NG),是淋病的病原菌。淋球菌革兰染色阴性，是严格的人体寄生菌，常存在于急性尿道炎与阴道炎的脓性分泌物的白细胞中，形态染色类似于脑膜炎球菌。淋球菌人类是淋球菌唯一的自然宿主。传播途径:成人----性接触 初生婴儿----患病母亲产道感染 治病物质：菌毛 外膜蛋白 脂多糖IgA 蛋白酶目前，实验室诊断淋球菌感染的方法有: ①直接涂片染色镜检验； ②分离培养法； ③免疫学方法； 分子生物学方法敏感，特异，可直接从临床标本中检出含量很低的病原菌，适于淋球菌的快速检测。 淋病奈瑟菌的基因组结构特征淋病奈瑟菌FA1090菌株是最早被完成测序研究的淋病奈瑟菌菌株之一染色体DNA长度为2.15Mbp，其中G+C含量为52.68%。共含有2069个基因，包括2002个具有编码功能的基因和67个编码结构性RNAs基因。淋病奈瑟菌的基因组结构特征Chung GT等人在2008年报道了淋病奈瑟菌新菌株NCCP11945的基因结构组。NCCP11945染色体的DNA长度为2.23Mbp,据估计可以编码2622个开放性阅读框。全基因组平均G+C含量为52.4%。这与FA1090菌株相似一、淋病奈瑟菌核酸的检测1.聚合酶链反应：PCR是分子生物学中最常用检测基因的技术手段，也是淋病奈瑟菌基因诊断中最基本的方法。PCR引物的设计应选择与其相应的靶基因，多采用：①隐蔽质粒cppB基因②16srRNA基因③porA假基因；④编码外膜蛋白基因(omp基因)⑤opa基因等；⑥胞嘧啶DNA甲基转移酶基因。不同靶基因设计引物对PCR的敏感性和特异性有一定的影响2.实时荧光定量PCR技术：该技术是目前临床检测NG的主要分子生物学技术。3.连接酶链反应：用于LCR方法检测的NG靶基因主要有opa基因和pilin基因。该法对于检测咽拭子标本具有很好的敏感性。4.链替代扩增技术 ：SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等温扩增技术。目前使用最多的是Becton Dikinson公司产生的Probe Tec ET，可以同时对CT和NG进行检测。Probe Tec ET特异性扩增NG染色体PviNg基因，然后用荧光标记的探针检测其相应的DNA靶序列，2小时可以完成96份标本检测。与培养法相比具有很高的敏感性和特异性。二、淋病奈瑟菌的耐药性检测 淋病奈瑟菌对抗生素的耐药机制主要由染色体和质粒的基因改变而引起。1.淋病奈瑟菌的主要耐药基因①gyrA和parC基因 DNA旋转酶是氟喹诺酮类药物作用的靶位，由gyrA和parC基因编码。gyrA基因突变可导致酶结构的改变，阻止氟喹诺酮类药物进入靶位，引起耐药。②pen,ponA基因 青霉素结合蛋白(PBPs)是淋球菌重要的外膜蛋白。编码 PBPs的基因主要有pen,ponA基因 ，若上述基因发生突变，就会导致PBPs的结构改变，PBPs与青霉素的亲和力下降，细胞膜对青霉素的渗透性降低，细菌产生耐药性。③porB基因 porB基因可编码淋球菌的孔蛋白(Porin，与细菌侵袭力有关).当发生基因突变时，孔蛋白对亲水性的抗生素渗透性下降，产生耐药。④Mtr系统调控基因 MtrR系统调控基因的突变会导致由它编码的MtrR阻遏蛋白减少消失，Mtr操纵子的转录增强，使MtrCDE基因表达增加，编码的泵蛋白外排活性增强，加大了脂溶性抗生素的排出，使菌体内药物蓄积不足，从而产生耐药性。⑤erm基因 erm基因编码erm酶，如果发生突变，erm基因编码的酶可使rRNA自动甲基化，从而使大环内酯类药物的作用靶位——核糖体50S亚基蛋白改变，使药物与靶位的亲和力下降引起耐药。2.淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术 ①DNA测序: 目前应用该技术进行检测的淋病奈瑟菌耐药基因主要有gyrA基因,parC 基因和erm基因。②PCR-SSCP: 是利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点，结合PCR技术进行基因检测的一种分析技术。目前被广泛应用与淋病奈瑟菌耐药突变的快速筛查研究。③PCR-RELP:不是所有淋病奈瑟菌耐药基因突变都存在特异性的限制性内切酶酶切位点，因此限制了该技术在临床中的应用。④基因芯片技术:应用于淋病奈瑟菌耐药基因突变筛查研究。三、分子生物学检测的临床意义 淋病奈瑟菌临床诊断主要依赖于实验室对淋球菌的检测，传统的涂片法简单，廉价，但敏感性低；近年来出现的新分子生物学技术具有较高的特异性和敏感性，大大缩短了检测时间，在淋病的早期诊断中具有重要临床意义：1.克服了淋球菌培养时间长等缺点，提高了临床样本检测的阳性率和准确性。2.通过分子生物学技术可以