人表皮干细胞的体外分、培养及鉴定.docVIP

人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定 何黎 顾华 昆明医学院第一附属医院皮肤性病科 云南 [摘要] 目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。 方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。 结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。 结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。 [关键词]：角质形成细胞 表皮干细胞 细胞培养 角蛋白——19 对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。人工皮肤的研制就是一个典型例子。在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。 材料和方法 材料 取材 选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。 主要培养基及试剂 (1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP超敏免疫组化试剂盒。 方法 取材 将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。 角质形成细胞的分离 将手术切除的包皮组织剪截成0.5大小皮片,75%酒精漂洗3次后，用含硫酸庆大酶素的PBS重复漂洗3次，再用PBS冲洗3-5次,放入装有10mldispase酶的离心管中放入4℃冰箱过夜。次日晨，用无菌弯头眼科镊轻轻揭下表皮，放入含有5ml0.05% 胰酶及0.01%EDTADE的50ml离心管，置于37℃消化吸收10min ，加入含有15%小牛血清的DMEM终止消化，滤网过滤残渣，将滤下的液体离心，弃上清，在加入不敷出10MLK-SFM培养基充分混匀后再离心一次，弃上清，加入5ml完全K-SFM培养基，用液管充分吹散细胞团。 细胞计数 将10ul细胞悬液与10ul台盼蓝充分混匀后，于计数板上计数，每次收集到的细胞 总在1×1之间，细胞活率90%以上。 4、角质形成细胞原代培养 将制备的角质形成细胞悬液以 1 的密度接种到25 塑料培养瓶中，置于37 ℃的培养箱中培养，48小时后换液，以后每3天换液一次。 5、角质形成细胞的传代培养 当原代培养角质形成细胞铺满瓶底约80%左右时，弃培养基，加入0.05%胰蛋白酶和0.01%EDTA 混合液，约3-5min后加入含15%牛血清的DMEM终止消化 ，然后离心弃上清，加入10 完全K-SFM培养基,记数后按 的密度接种到25 塑料培养瓶中,置于37 ℃ 的培养箱中培养,每2-3天换液一次.代长满培养瓶约80%后,重复上述步骤继续传代培养. 6 角质形成细胞的鉴定 (1) 倒置显微镜观察 将原带代培养的角质形成细胞接种之后, 倒置显微镜观察细胞形态及动态变化,并于培养后1天3天5天7天9天11天照相. (2) 透射电子显微镜观察将传代培养的角质形成细胞按常规方法处理后,置于100C-X透射电子显微镜下观察并照相. (3) 免疫组化染色 将原代培养的角质形成细胞调整细胞悬液进行免疫组化染色.以光谱的鼠抗人角蛋白单克隆抗体及CK19分别作为一抗,以PBS作为阴性对照. 结 果 角质形成细胞的分离及培养