第八章酵母基因工程.ppt

2）半乳糖激酶启动子（GAL1） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控 B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 2）半乳糖激酶启动子（GAL1） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 Promoter GAL10 3）pho4TS-PHO5启动子 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录 B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子 C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭 D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达 低温诱导、磷酸盐抑制 酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL 2、酿酒酵母分泌系统 *保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用 *信号肽结构： 酿酒酵母信号肽特点 正电荷区 疏水区 极性区 Met 目的蛋白 信号肽剪切位点 *分泌效率高 *在酵母系统具有通用性 *88个残基组成 MF-α信号肽 Met 目的蛋白 -Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala- KEX2 DAP DAP DAP：STE13编码的二肽酶 糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化 3、酿酒酵母糖基化系统 * 过糖基化（超糖基化修饰）： N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成 O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团 酿酒酵母糖基化特点 1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵 2）分泌表达产物过糖基化 4、酿酒酵母表达系统的缺陷 酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢 酿酒酵母表达系统 酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得 有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能 大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。 酵母菌表达系统的选择 乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源 蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优 于酿酒酵母表达系统。 酵母菌表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生 巴斯德毕赤酵母表达系统 长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长 迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯 德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因 的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因 具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。 的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种 酵母菌表达系统的选择 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被 多型汉逊酵母表达系统 克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载 体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多