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构建线粒体钙离子摄入蛋白1慢病毒表达载体及在H9C2细胞中的应用 荆 哲1，刘峰舟2，刘 燕1，陈永清1 (1解放军兰州军区兰州总医院心内科，甘肃省兰州市 730050；2西京医院心内科，陕西省西安市 710032) 引用本文：荆哲，刘峰舟，刘燕，陈永清. 构建线粒体钙离子摄入蛋白1慢病毒表达载体及在H9C2细胞中的应用[J].中国组织工程研究，2016，20(37):5560-5566. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.013 ORCID: 0000-0002-6829-4901(荆哲) 文章快速阅读： 文题释义： 线粒体功能紊乱：主要以线粒体钙稳态失衡为角度阐述线粒体功能紊乱在细胞生物学功能中所发挥的作用。细胞线粒体钙主要与细胞胞浆钙稳态、线粒体三羧酸循环关键酶、细胞自噬、生存、死亡以及线粒体的空间位置等关系密切。 线粒体钙离子单向转运复合体：目前研究发现，该复合体主要以构成线粒体内膜孔道的线粒体钙离子单向转运蛋白，以及调剂其活性的MICU1，MICU2，MCUR1及EMRE组成，共同完成细胞线粒体钙摄取的精密调节。 摘要 背景：线粒体钙离子摄入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1, MICU1)是维持细胞线粒体钙稳态的重要分子，MICU1对线粒体钙稳态的调节可能在糖尿病心肌病的发生及发展中起着重要作用，但目前机制尚不明确。 目的：构建MICU1基因的慢病毒表达载体，产毒感染H9C2细胞，评价MICU1基因在H9C2细胞中的表达效果，为后续在细胞水平研究糖尿病心肌病的发生及发展建立平台。 方法：PCR提取H9C2细胞MICU1基因，SpeⅠ、EcoRⅠ双酶切后，将MICU1基因片段插入慢病毒载体pRRLsin.CMV.eGFP中，构建慢病毒表达质粒pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP。使用pCMVDR8.91、pCMV-VSVG共转染于293T细胞中包装产毒，用于感染H9C2细胞。通过RT-PCR及Western blot检测感染后H9C2细胞中MICU1 mRNA及蛋白的表达。共聚焦显微镜检测Rhod-2染色H9C2细胞后线粒体钙水平。 结果与结论：①MICU1基因成功插入pRRLsin.CMV.eGFP慢病毒表达质粒；②转染pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP慢病毒表达质粒后，可见293T细胞表达绿色荧光蛋白，并且MICU1的蛋白表达明显升高；③病毒液感染H9C2细胞后，MICU1的蛋白及mRNA水平较未感染组及空质粒包装组明显升高；④Rhod-2染色后观察发现，MICU1能够明显增强线粒体钙水平；⑤结果表明，pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP慢病毒能够高效感染H9C2细胞，为构建永生化细胞系奠定基础。 关键词： 组织构建；组织工程；H9C2细胞；线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1)；慢病毒载体；病毒包装；钙 主题词： 慢病毒感染；线粒体蛋白质类；肌细胞, 心脏 Construction of lentiviral vector carrying mitochondrial calcium uptake 1 and its use in infected H9C2 cells Jing Zhe1, Liu Feng-zhou2, Liu Yan1, Chen Yong-qing1 (1Department of Cardiology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; 2Department of Cardiology, Xijing Hospital, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China) Abstract BACKGROUND: Mitochondrial calcium uptake 1 (MICU1) is one of the important molecules to maintain the mitochondrial calcium homeostasis. The regulation of MICU1 to mitochondrial calcium homeostasis may play an important role in diabetic cardiomyopathy, but the underlying mechanism remains unclear. OBJECTIVE: To