RNAi和siRNA转染.pptx

RNAi和siRNA转染内 容第一部分 RNAi实验基本概念第二部分RNAi实验具体设计第三部分siRNA转染过程相关问题及解答第一部分RNAi实验基本概念主要内容1.RNAi的概念2.RNAi的启动途径3.非哺乳动物系统的RNAi实验4.哺乳动物系统的RNAi实验5.RNAi效应表现1.RNAi的概念RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。2006年度诺贝尔生理学或医学奖共同授予安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛，他们发现了“RNA干扰机制—双链RNA沉默基因”。2.RNAi的启动途径(1) dsRNA途径(2) siRNA途径(3) shRNA表达载体途径(1) dsRNA途径dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi的发生。但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素效应）降解dsRNA。(2) siRNA途径小干扰RNA，长21-23bp，双链。作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的沉默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。(3) shRNA表达载体途径shRNA（short hairpin RNA）表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，导致RNAi的发生。可能具有细胞毒性。shRNA可能通过竞争Exportin-5造成致命毒性3.非哺乳动物系统的RNAi实验如线虫、果蝇等不涉及抗病毒免疫应答反应，可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常200bp）介导RNAi的发生 。长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。长链dsRNA进入细胞后可被Dicer酶水解为多个混合的siRNA，敲除效果更好。4.哺乳动物系统的RNAi实验通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的基因表达抑制时间。通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载体较为合适。5.RNAi效应表现RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。第二部分哺乳动物系统的RNAi实验设计主要内容1. 需要短期抑制还是长效抑制?2. 采用siRNA进行实验的途径3. 构建shRNA表达载体进行实验4. siRNA设计需要注意的问题5. 脱靶效应6. 转染是RNAi实验的瓶颈1.需要短期抑制还是长效抑制?1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长。2. 采用siRNA进行实验的途径化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA(2) 体外转录：费时，成本低，所需有效浓度低，适用于大量筛选siRNASilencer? siRNA Construction Kit（ThermoFisher）(3) Dicer/RNaseⅢ酶解非哺乳动物系统的RNAi三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率3.构建shRNA表达载体进行实验需要构建相关质粒可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表达不能做荧光标记，无法直观知道转染效率4.siRNA设计需要注意的问题(1) siRNA序列设计(2) 阴性对照的作用(3) 阳性对照的重要性(4) siRNA荧光标记的问题(1) siRNA的设计理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。(2) 阴性对照siRNA的作用阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。(3) 阳性对照siRNA的重要性阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛－3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因；用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法是否可行等；阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重