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实验三 PCR扩增目的基因 【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ； 3．了解PCR的优化环节，学会如何优化PCR。了解PCR产物的保存方法； 【实验器材】 PCR仪，台式离心机，微量移液器（20μl, 200 μl 1000 μl ）,0.2 μl Enpendorf管，电泳设备等 【实验材料】 大肠杆菌AKP基因DNA模板，引物，4dNTP，Taq酶，PCR缓冲液、无菌水，琼脂糖，DNA染料，电泳缓冲液等。 【实验内容】 PCR基础知识介绍； PCR的基本原理； PCR引物设计原则； PCR的基本过程及程序设计； 【实验原理】 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2）PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤：变性、退火和延伸，3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 【操作步骤】 1. 建立PCR反应体系（依次混匀下列试剂） 2. 将加好的管充分后，离心数秒，放入PCR仪上。 3. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪。 电泳 　PCR完成后，取6-8μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。 [注意] PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 思考题 　1.降低退火温度对反应有何影响？ 　2.延长变性时间对反应有何影响？ 　3.循环次数是否越多越好？为何？ 　4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？ 程序设计 开机 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 体外程序化的DNA合成技术。 PCR PCR扩增 PCR特点及应用 特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可  靠，快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。 PCR应用 基因组DNA分析 genomic assay 克隆基因或基因片断 Cloning of genes or gene fragments 遗传病的诊断 Genetic diagnosis 亲子鉴定 Paternity testing 反转录PCR Reverse transcription (RT)-PCR 犯罪现场的法医分析 Forensic analysis at scene of crime 传染病的分析 Assays for the presence of infectious agents 遗传病的产前诊断 Prenatal diagnosis of genetic diseases 体外突变与DNA工程 In vitro mutagenesis and engineering of DNA 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence variations PCR反应中的成份 1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。 引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： (1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长浪费。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布，在3‘端避免连续3个G或C,因这样易导致错误引发。 (4) 引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二 2. 四种三磷酸脱氧核苷酸(4XdNTP) dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合