蛋白质纯化技术.pptVIP

4.2.3 等电聚焦电泳（Isoelectric focusing—IEF） 等电聚焦（Isoelectric focusing） 4.2.4 双向电泳 第一向：等电聚焦 （pI） 第二向：SDS(MW) 双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一。 ①Isoelectric focusing ②SDS gel electrophoresis 二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤 总原则 以合理的效率、速度、收率和纯度， 将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来， 同时仍保留其生物学活性和化学完整性。 二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤 步骤 选择实验材料，实验材料预处理 蛋白质的提取 蛋白质的粗分级 蛋白质的细分级 蛋白质的鉴定 蛋白质纯化的前期准备 关于蛋白质我们已知什么？ 最好的来源？ 蛋白质纯度要求？活性要求？ 纯化蛋白的量？ 如何进行鉴定？ 纯化时间长短？ 最终花费？ 纯化方案？ 1、选择实验材料及预处理 选择实验材料 物种的选择 组织的选择 实验材料预处理 液体材料 过滤 离心 固体材料 洗涤：自来水—蒸馏水—提取缓冲液 材料破碎： 材料破碎 机械剪碎 研磨 反复冻融法 超声破碎法 高压匀浆法 酶解法 2、蛋白质的提取 ①提取分离原则 尽可能多地提取目的蛋白，同时避免活性丢失（温度过高、 pH、有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素） 选择合适的pH、选择合适的离子强度 2、蛋白质的提取 ②提取液成分的确定 pH 缓冲液：Tris-HCl, Tris-Gly, Gly-HCl, 柠檬酸-柠檬酸钠… 离子：动物 NaCl, 植物KCl 还原剂:DTT… 蛋白酶抑制剂：EDTA, PMSF… 金属离子螯合剂: EDTA, EGTA… 去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20 甘油 ③温度 0~4℃ 3、蛋白质的粗分级（粗提） 使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质。 常用的实验技术：沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、超速离心、透析、超滤… 4、蛋白质的细分级 粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化。 常用的实验技术：层析 4.1. 层析（ chromatography ） 固定相：凝胶 流动相：缓冲液 原理： 凝胶介质 Pharmacia BioGelA agarose BioGel P acrylamide Bio-Rad Sephadex glucose (dextrose) Sepharose agarose Sephacryl glucose + acrylamide Sephacel cellulose 层析装置（Chromatographic equipment） 蠕动泵 层析柱 检测器 记录仪 部分收集器 ① ② ③ 4.1. 层析（ chromatography ） 分子筛层析（ Gel filtration ） 离子交换层析（ Ion exchange ） 疏水作用层析（ Hydrophobic interaction ） 亲和层析（ Affinity ） 4.1.1 分子筛层析 （Gel filtration） 原理 也称为凝胶过滤、排阻层析。是以多孔凝胶材料为支持物，当蛋白质溶液流经此支持物时，分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出，从而达到分离纯化的目的。 凝胶介质 葡聚糖 （glucose） 琼脂糖 （agarose） 聚丙烯酰胺（acrylamide） 纤维素（cellulose） 分子筛层析Gel filtration chromatography Hydrophilic No spontaneous binding to proteins. Chemically and physically stable Rigid to allow a high linear flow-rate 亲水 对蛋白质亲和力低 物理化学性质稳定 流速稳定 分子筛层析Gel filtration chromatography 分子筛层析Gel filtration chromatography 分子筛层析Gel filtration chromatography 4.1.2 离子交换层析（ Ion exchange ） 原理 在一定的pH条件下，不同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电