重组乙型肝炎疫苗(酿酵母).docVIP

重组乙型肝炎疫苗酵母） Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Jiaomu) Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant DNA Techniques in Saccharomyces CerevisciaeYeast 本品系由重组酵母菌表达的乙型肝炎(简称乙肝)病毒表面抗原（HBsAg）经纯化、加入铝佐剂制成，用于预防乙型肝炎。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。 2 制造 2.1 生产用菌种 2.1.1 名称及来源 生产用菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酵母原始菌种，菌种号为2150-2-3（pHBS56-GAP347/33）。 2.1.2 种子批的建立 应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。 由美国默克公司提供的菌种经扩增1代为主种子批，主种子批扩增1代为工作种子批。 2.1.3 种子批检定 主种子批及工作种子批应进行以下项目的全面检定。 2.1.3.1 培养物纯度 培养物接种于哥伦比亚血琼脂平板和酶化大豆蛋白琼脂平板，分别于20~25℃和30~35℃培养5~7天，应无细菌和其他真菌被检出。 2.1.3.2 HBSAg基因序列测定 应与美国默克公司提供菌种的HBSAg基因序列保持一致。 2.1.3.3 质粒保有率 采用平板复制法。将接种到复合培养基上培养，得到的单个克隆菌落转移到限制性培养基上培养，计算质粒保有率，应不低于95%。 PR= [A /（A+L）] ×100 式中 PR为质粒保有率，％； A为在含腺嘌呤的基本培养基上生长的菌落数，CFU/皿； A+L为在含腺嘌呤和亮氨酸的基本培养基上生长的菌落数，CFU/皿 2.1.3.4 活菌率 采用血细胞计数仪器， 分别计算每毫升培养物中总数和活数，活菌率应不低于50% 活菌率=活数/总数×100% 2.1.3.5抗原表达率 取种子批菌种扩增培养， 采用适宜的方法将培养后的细胞破碎，分别用Lowry法测定破碎液的蛋白质含量， 并采用酶联免疫法或其他适宜方法测定HBsAg含量。抗原表达率应不低于0.5% 抗原表达率=抗原含量/蛋白含量×100% 2.1.4 菌种保存 主种子批和工作种子批菌种应于液氮中保存，工作种子批菌种保存于-70℃应不超过6个月。 2.2 原液 2.2.1 发酵 取工作种子批菌种，于适宜温度和时间经锥形瓶、种子罐和生产罐进行三级发酵，收获的酵母菌应冷冻保存。 2.2.2 培养物检定 2.2.2.1 培养物纯度 同2.1.3.1项。 2.2.2.2 质粒保有率 平板复制法测试的质粒保有率应不低于90%。 2.2.3 培养物保存 于－60℃以下保存不超过6个月。 2.2．4 纯化 用细胞破碎器破碎酵母菌，除去细胞碎片，以硅胶吸附法粗提HBsAg，疏水层析法纯化HBsAg，经硫氰酸盐处理后，稀释和除菌过滤后即为原液。 2.2.4 原液检定 按3.1项进行。 2.2.5 原液保存 于2－8℃保存不超过3个月。 2. 3 半成品 2.3.1甲醛处理 原液中终浓度为100μg/ml加入甲醛，于37℃保温适宜时间。 2．3.2 铝吸附 每微克蛋白和铝剂按一定比例置2-8℃吸附适宜的时间，用无菌生理氯化钠溶液恢复至原体积， 即为铝吸附产物。 2.3.3 半成品配制 蛋白质浓度为20.0~27.0 μg/ml的铝吸附后原液可与铝佐剂等量混合后，即为半成品。 2. 3. 3 半成品检定 按3.2项进行。 2. 4 成品 2.4.1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3规格 每瓶0.5 ml、1.0 ml。每1次人用剂量0.5 ml（含HBsAg 5 μg或10μg）或1.0 ml（含HBsAg 10 μg）。 2.4.4 包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1无菌检查 依法检查（附录XⅡ A）， 应符合规定。 3.1.2 蛋白质浓度 应为20.0~27.0 μg/ml（附录VI B二法）。 3.1.3 特异蛋白带 依法测定(附录IV C)，μg，银染法染色应有分子量为20~25kD蛋白带，可有低于24kD蛋白带及HBsAg二聚体蛋白带。 3.1.4 N末端氨基酸序列测定（每年至少进行一次该项测定） N末端氨基酸序列应为……………. 3.1.5 纯度 采用免疫印迹法测定（附录 VIII A），所测供试品不得出现国家药品检定机构认可以外的酵母杂蛋白；采用高效液相色谱法（附录III B），HBsAg含量应不低于99.0%，或杂蛋白应不高于1.0%。 3.1.6 细菌内毒素检查