PacBioRSII的高通量测序应用.docxVIP

PacBio RS II 的高通量测序应用Pacific Biosciences 公司的PacBio RS II/newsf/search.asp?keyword=单分子单分子实时测序（single molecule, real-time，SMRT）测序反应是在其专利SMRT cell中进行的，每个SMRT cell中有150,000个ZMW（纳米级的零模波导孔zero-mode waveguides）,每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链，SMRT Cell能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。当测序进行时，专利的包被技术保证DNA 聚合酶和模板形成的复合体被锚定在 ZMW 的底部，反应溶液中带有标记着不同荧光磷酸基团的高浓度核苷酸可有效保证聚合酶合成的速度、精确性和持续合成的能力；检测装置则透过ZMW 底部的基层来实时观察 DNA 的合成过程：当 DNA 聚合酶检测到正确的核苷酸并将其插入模板时，这些碱基会在插入位置保留几十毫秒，而游离状态的碱基扩散的速度大约是几十微秒，在这个时间差中，检测器就可以检测到插入碱基的荧光信号，并将其转换成相对应的碱基类型。然后，DNA 聚合酶将碱基所带的标记着荧光集团的磷酸基团剪掉以形成天然DNA 链，荧光信号迅速衰减至基线并开始下一轮的合成。PacBio RS II使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成对应的ACGT碱基信息。一旦测序开始，实时的数据就被传送到初步分析系统中，以实时生成碱基组成和质量值等信息。单分子测序建库不经PCR扩增，精巧的ZMW设计有效将背景干扰降到最低，通过检测碱基配对动力学变化现超长读长、减弱GC偏向性等技术特点，使得PacBio RS II测序具有以下测序优势：超长的测序读长：NGS读长在35-700bp之间，而PacBio RS II平均测序读长能达到3-10kb，最长的序列能达到20kb；极高的准确率：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；选用特殊测序模式，测序准确率可以在达到单个分子99%准确率的条件下，读长超过经典的Sanger测序法；最小的GC偏向性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度；无PCR扩增偏向性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR artifacts.现上海翰宇生物和上海南方基因中心合作，拥有PacBio RS II /newsf/search.asp?keyword=单分子单分子实时测序平台，通过其优良的测序特性，致力于为广大科研工作者等提供优质高效的测序服务。下面上海翰宇生物将对PacBio RS II的应用进行简要概述：基于PacBio RS II /newsf/search.asp?keyword=单分子单分子实时测序的强大性能，在基因组、转录组和表观遗传学方面有了更大的应用突破。全基因组de novo测序与二代测序最高不超过1kb的读长相比，PacBio RS II的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。同时，与二代测序的模板样品需要扩增相比，PacBio RS II无需扩增可直接对单个分子进行测序，有效避免了PCR扩增偏好性和GC偏好性，PacBio RS II可轻松跨越GC含量异常（过高或过低）及高度序列重复的区域，实现序列覆盖的完整性和均一性。 基因组草图的优化及基因组完成图绘制对前期已开展测序的动植物、微生物基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。针对前期已经开展全基因组测序，获得基因组草图的动植物、微生物等，可以结合PacBio RS II平台长读长reads进行补充，从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度。另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息（structural-variation events）、串联重复序列信息（tandem duplication）、易位信息（Inversion）等。全长转录本测序PacBio RS II的长读长可实现全长转录本测序，并使基因可变剪接形式的识别成为可能，因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究。同时，长读长不再需要对RNA-Seq的reads进行组装，因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释，用以改进参考基因组中的基因注释信息。宏基因组测序长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定，能够更加快捷地获得更多微生物种的全基因组序列。16S rDNA全长测PacBio RS II的平均读长为8-10Kb，而16S rDNA长度大约为1540bp，因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列。细胞器基因组测序叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂