分子生物学实验指导_LSW讲义.docVIP

实验一 质粒DNA的小量制备 （碱裂解法） 实验原理 所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。 本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。碱裂解法对于以前应用的所有的大肠杆菌均卓有成效。该方法的特点是，加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞壁裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀法或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡法。 环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（L DNA），通称L构型。质粒DNA Mr一般