动物肝脏DNA提取和鉴定-实验技术程序.ppt

核酸含量的测定方法：紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。 脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收 。 DNA20~400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。 三、实验试剂 95%冷乙醇、NaCl固体 二苯胺：称取纯二苯胺1g溶于100ml冰醋酸中，加入10ml过氯酸，混匀。临用时加1ml1.6%乙醛溶液，所配置试剂应为无色。 0.14mol／L NaCl－0.05mol／L 柠檬酸钠缓冲液(PH=6.8) DNA标准液200ug/ml:DNA钠盐用5mmol/L的NaOH配制。 氯仿/异戊醇=20：1（V/V） 5% SDS 组织捣碎匀浆机 猪肝8g 匀 浆 16ml的0.14mol／L NaCl－0.05mol／L 柠檬酸钠缓冲液 离心，4000r/min ,10min 上清（弃掉） 沉淀 沉淀 25ml缓冲液洗涤 离心，4000r/min ,20min 上清（弃掉） 40ml的0.14mol／L NaCl－0.05mol／L 柠檬酸钠缓冲液 沉淀 21ml氯仿/异戊醇 4ml 5% SDS 振荡 30 min（保鲜膜封口） 加入3.6gNaCl 固体，终浓度为1mol/L 离心，3500r/min ,20min 吸取上清（量取体积） 95%冷乙醇（缓慢加入）边加边朝一个方向缓慢搅动 DNA粗制品 STAR STAR * * * 动物肝脏DNA的制备和鉴定 甘肃中医药大学 核酸的分类 DNA (脱氧核糖核酸) 主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA（核糖核酸） 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 核酸的理化性质 在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来 浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。 离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。 苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 基因组DNA的提取方法 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠 作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质 溶菌酶：破碎细胞 核酸提取的主要步骤 沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质 除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤 除去其它不需要的核酸分子 破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶） 注意事项 加入RNA降解酶除RNA 加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等 蛋白变性剂反应不宜过于剧烈 避免过酸、过碱及高温 一、实验目的： 1、学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理。 2、学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。 二、实验原理 核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。 DNA-Pro（DNP） 细胞核 RNA-Pro(RNP)