815基因打靶探究.pptVIP

基因打靶技术 gene targeting 用含已知序列的基因片段与受体细胞基因发生同源重组，定点改变某一特定基因的技术手段。 建立在胚胎干细胞和同源重组技术基础上，定向改变活体遗传信息，分为胚胎干细胞和体细胞打靶两类。 基因打靶技术的优点 位点精确度高：精确的定点修饰，克服了随机插入对相邻序列的不良影响。 定量精确度高；拷贝数确定，避免了缺乏量化概念的随机导入。 稳定性强：确保整合至染色体稳定遗传。 具有时空性：打靶效应具有发育特异性、组织特异性和人为操控性。 基因打靶技术 发生在DNA同源序列之间或有相同或近似碱基序列之间的遗传交换。要有重组酶等一系列酶等的参与。(RecA) DNA同源重组模型 典型的基因打靶载体构建 正选择标记Positive selection marker 正选择标记基因在细胞内整合后，抗药性基因表达，使细胞能在相应的抗性药物中存活。即细胞在标记基因转入后存活。 使有毒药物变无毒。 如neo抗性基因对G418。即整合后使细胞产生抗药性而存活。 Neo 编码的新霉素磷酸转移酶 G418 一种与新霉素结构相似的氨基糖类抗生素 正向选择法 载体上有缺失自身调控因子的正向选择基因，只能在整合后利用靶位点上相应的表达调控元件启动表达。 例如去掉启动子和起始密码子。结果： 随机整合1—选择标记基因表达受阻 随机整合2—刚好整合在其它基因调控元件部位，启动选择标记基因表达。 同源重组—重组位点正确，基因表达。 用酶切图谱或印迹杂交鉴定重组克隆。 正向选择法 负选择标记negative selection marker 负选择标记基因在细胞内整合后，药物转化型基因表达，使细胞能在相应的抗性药物中死亡。即细胞在标记基因转入后死亡。 使无毒药物变有毒。 如HSV-tk产物可转化GCV成细胞毒性物质，导致细胞死亡。 HSV-tk编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶 GCV/GANC 更昔洛韦（抗疱疹药物） 正负双向选择法 载体正向选择基因位于同源区内，随机整合与同源重组时均表达。负选择基因位于同源区之外，同源重组时被切掉，而随机整合时被保留。 无整合: 细胞被正性选择药物杀死； 随机整合:细胞被负性选择药物杀死； 同源重组:对正性和负性药物均有抗性。 neo/tk正负双向选择系统 HAS-TK：产物能转化GCV而杀死细胞。 HAS-TK插入到载体的重组区外侧，同源重组时TK丢失。随机整合时，整合部位同时获得neo和HAS-tk两个基因，加入GCV后细胞死亡。 未整合： neo-/tk-，细胞在G418中死亡。 随机整合：neo+/tk+，细胞在GCV中死亡。 同源重组：neo+/tk-，两种药物均存活。 Hprt+/Hprt-正负双向选择系统 细胞内次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hprt)常作为打靶基因报告基因。 正常细胞（Hprt+）能在HAT培养基中生长，作为正向选择标志。利用补救途径 改造细胞（Hprt-）能在6-TG培养基中生长，作为负向选择标志。弥补补救途径 HAT：次黄嘌呤,甲氨喋呤,胸腺嘧啶 6-TG: 6-巯基鸟嘌呤 标记基因定点突变筛选 靶细胞基因组存在负选择标记基因。 打靶载体有能插入负选择标记基因的同源序列和正选择标记基因，导入受体细胞后用两种药物进行筛选。结果如下： 未整合细胞在任一药物中全部死亡。 随机整合细胞在负选择性药物中死亡。 同源重组细胞在两种药物中均能存活。因为同源重组造成细胞固有的负选择标记基因失活。 基因置换型载体gene-replacement vector 正向选择标记在同源序列内侧，重组结果是载体上的同源序列取代靶序列。 基因置换型载体 置换型载体线性化点位于同源序列外侧，结果是载体同源序列取代靶序列。 基因插入型载体 插入型载体线性化点位于同源序列内部，重组结果是整个载体插入到基因组序列内部，干扰了目标基因的功能。 基因插入型载体gene-insertion vector 正向选择标记在同源序列外侧，重组结果是整个载体整合到靶位点上，从而干扰目标基因的功能。功能性删除。 基因治疗型载体Vector in gene therapy 载体上有取代基因，对基因突变而丧失正常功能基因的纠正。 基因治疗临床试验 基因治疗临床试验 基因捕获gene trap 将报告基因随机插入基因组，通过内源基因启动报告基因表示突变存在，建立随机插入突变体的胚胎干细胞库。 在整合位点利用靶基因调控原件模仿靶基因表达报告基因，而终止靶基因自身表达，阐明靶基因的功能。 诱捕载体本身无启动子，需借助内源基因的调控元启动Neo和lacZ等报告基因。 基因捕获载体 启动子捕获载体 增强子捕获载体 打了就走策略 (Hit and Run )