第七章超高效液相色谱法.ppt

超高效液相色谱法（UPLC） 色谱实验室的新高度 Jorgensen博士和杨百翰大学的M. Lee博士最近都发表了关于色谱实验室未来分析范围的深刻见解。他们的研究为分离科学描绘了一幅新图景。通过使用比以前小得多颗粒，使分离过程达到了一个新的终点。 范第姆特方程是一个描述线速度与塔板高度（柱效）关系的经验式。从图1可以看出，一旦填料的颗粒大小低于2 μm，色谱技术就能达到一个新水平：不仅柱效更高，而且随着流速的提高不会使柱效降低。 如果使用UPLCTM技术和2 μm以下的颗粒，那么即使在较高的线速度下，效率也能得以保持。更短色谱柱和／或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏度，从而使现在有可能充分利用色谱原理进行分离。 峰容量被定义为色谱法每单位时间内所能分辨的峰数量。峰容量和分离速度等性能指标得到提高后的色谱法被称为超高效液相色谱法，或UPLC。图2说明了当颗粒大小从5 μm减小至1.7 μm时，增加的峰容量对色谱分离性能的影响。 源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对于任何给定的分离，都可通过调节这些变量而达到速度和分辨率的最佳组合 图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须使用多孔型颗粒。 UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒又能避免堵塞。 3 μm是15 cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这是在色谱柱达到最佳流速而又不超出市售仪器（使用任何配比的甲醇－水混合溶剂）的压力限制范围的条件下，运行系统所能使用的最小颗粒大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗粒是0.67 μm 为了达到颗粒小、峰容量大的分离效果，需要比目前使用的HPLC仪具有更广的压力范围。在能达到最大效率的最佳流速下，对于10 cm长装有1.7 μm颗粒的色谱柱，计算得出的压力降是15,000 psi。因此，需要一个能在该压力下传送溶剂的泵。 在这些条件下，溶剂的可压缩性将会变得显著，特别是在多溶剂和梯度分离条件下。UPLC的溶剂传送系统应不仅仅具有高压泵抽吸功能，同时在等度和梯度分离模式下使用各种溶剂，溶剂传送系统必须能抵消溶剂可压缩性引起的大范围潜在压力波动，以实现平稳而可重现的流体输送。 普通进样阀，不论是手动的还是自动的，都不具有极端压力下的耐用功能。进样的可重现性和线性的典型性能标准是分析应用所需要的 为保护色谱柱免受极端压力波动的影响，进样过程应尽可能排除脉冲干扰。仪器的系统体积要小，以减小所检测样品可能的区带展宽。在快速进样循环中，UPLC能以最大速度、较大的样品通量进行工作 理论情况下，配备1.7 μm颗粒的UPLC系统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须具有较高的采样速率，以在检测峰通过时捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测峰进行准确而可重现的识别（和积分） 检测器必须有最小的扩散体积，以确保分离效率不降低。检测器的光学部件也必须具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于UPLC的性能特征,使与UPLC相连的质谱仪的灵敏度至少提高3倍 除了化学、泵、进样器和检测器之外，还需要对系统进行考虑。系统的体积至关重要。如果要在色谱分析过程中保持UPLC分离的高性能，则UPLC的系统总体积必须大大低于目前的HPLC系统.如：考虑连接管和接头配件 UPLC技术能实现提高液相色谱速度、分辨率和灵敏度的承诺，为每次分析提供更多的信息；因此，该技术将会得到实验室的广泛认可。 超高效液相色谱法（UPLC）相对于高效液相色谱法（HPLC）的优势所在： 1.速度 超高效液相色谱法（UPLC）采用新型全多孔球形1.7μm反相固定相，该固定相是应用“杂化颗粒技术”（hybrid particle technology，HPT）合成的，并由此制备了高柱效的ACQUITY UPLC色谱柱。这使得在常规高效液相色谱需要30分钟时间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5分钟，并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超高柱效。 2.灵敏度 我们知道UPLC色谱柱中使用的是1.7