载体构建流程.ppt

经典载体构建流程 I 载体构建流程 cDNA 提取mRNA 得到目的基因 RT PCR PCR产物纯化 酶切目的基因和载体 纯化酶切产物 连接 转化 菌落PCR 挑取阳性克隆去测序 测序正确的摇菌提质粒 保菌 导入表达宿主 测试表达情况 提取mRNA 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。 RT 由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码的mRNA为模板。 PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA为模板扩增目的基因。 根据不同的目的，可有三类引物选择 PCR得到目的基因  刚开始摸条件时，都会先做一个梯度PCR，选出最适条件。 由于此步为获取正确的目的基因，所以尽量避免PCR的突变格外重要。其中所采取的措