第四章核素稀释法.ppt

第五章 核素稀释法 核素稀释法（Nuclide Dilution Technique） 系一种应用极为广泛的定量示踪法 在成分复杂的样品中测定某些成分，在混合物中分析性质类似、不易定量分离的元素以及测定整体内无法定量分离的某些成分的总量等。 放射性核素 稳定性核素 第一节 核素稀释法的基本原理 标记化合物--已知比活度为s1、质量为m1非标记物质量为m2的同一种化学形态的均匀混合时，标记分子被非标记分子所稀释， 混合物的放射性比活度s2必然比s1低。混合前后的总放射性应相等，即 s2（ml＋m2）＝ slm1 （5·1） s2（ml＋m2）＝ slm1 如m2m1，上式可简化为s2m2=s1ml 故如ml和m2中有一个量为已知，只需测定混匀后样品的放射性比活度，就可算出另一量。 测定s2时，样品不需要定量分离。 放射性比活度 ： Bq或其派生单位/mol或其派生单位 若稀释前后放射性探测效率相同，分子也可用cpm表示。若已知标记与非标记物分子量差别很小，或标记物在稀释前的放射性比活度不甚高，或某些生物大分子无法确知其分子量，则分母也可用g表示 m1和m2也应以mol或其派生单位 分析对象是液体，以及稀释前后物质在溶液中的浓度基本不变，也可用放射性浓度c（如dpm/ml）代替放射性比活度s，用稀释前后的体积υ代替质量m，写成如下关系： c2（υl十υ2）＝c1υ1 ? 第二节 基 本 方 法 一、核素正稀释法Direct Nuclide Dilution 已知量的标记物作为示踪剂来测定未知量非标记物的稀释法称为核素正稀释法 设:标记物的化学量为Y mmol， 非标记物的化学量为X mmol 放射性活度为D， 则稀释前记物的放射性比活度s1： 标记物和非标记物充分混匀后进行提纯，分离出任意量，测混合后样品的放射性比活度s2： ? 举例： 欲测定蛋白质水解液中天冬氨酸的含量，将5mg放射性比活度为17kBq/mg的标记天冬氨酸加入水解液，充分混匀后分离出一部分高度纯化的天冬氨酸0.21mg，测得放射性比活度为0.37kBq/mg，求水解液天冬氨酸的含量。 解：已知Y=5.0mg，s1=17kBq/mg，s2=0.37kBq/mg，代入公式则 二、核素反稀释法 核素反稀释法（Inverse Nuclide Dilution） 用已知量的非标记物测定样品中标记物含量的稀释法称核素反稀释法 设标记物的化学量为g （未知） 已知或测得其放射性比活度为（s1=D/g） 因不能定量分离，加入同一化学形态的非标记物，已知其化学量为r 混合后分离部分样品纯化，测得放射性比活度为s2 s2（m1＋m2）=slm1 若已知所加非标记物的量r，则分别测量两个放射性比活度s1和s2，即可求得标记物的量g。有时，样品中只有一种标记化合物，则可简化实验步骤，不测s1，而改为测样品的总放射性D。因为D＝gs1，上式可改成 举例： 用14CO2通过植物光合作用生成放射性蛋白质，取少量蛋白质水解分出谷氨酸测得放射性比活度为356 cpm／mg，欲求谷氨酸含量，取166 mg mg蛋白样品，水解后加入非标记谷氨酸13.1 mg，混合后分出部分谷氨酸，测得放射性比活度为220 cpm／mg。 解：设g为标记谷氨酸量，r＝13.1 mg，s1=356 cpm／mg, s2＝220 cpm／mg， 三、特殊核素稀释法 1．核素双稀释法（Double Nuclide Dilution） 核素双稀释法主要用于反稀释法。当样品中未知量为g的标记物；其放射性比活度Sg不易直接测量时，可采用双稀释法。 2．亚化学计量核素稀释法 （Substoichiometric Nuclide Dilution Analysis） 亚化学计量核素稀释法是将亚化学计量分离原理用于核素稀释法的一种分析技术。 第三节 必要的条件 必要的条件是制备和待测物质化学上完全相同的标记物和建立分离、纯化样品的可靠方法。 1.正确选用标记物: 标记物在化学性质上要和待测物完全相同；标记原子要在化合物的稳定位置；标记的纯度要高；用于整体成分测定时还要求标记原子在体内也不发生非代谢性交换；生物行为与非标记物完全一致；标记物必须无毒性。 2.准确的稀释度 为使分离出的样品具有准确稀释度，必须确保标记原子和非标记原子混合均匀。进行体内稀释实验时，完全混匀的时间一般通过实验确定。 3.建立分离、纯化样品的可靠方法 分离、纯化