第9章PCR摘要.ppt

第9章 聚合酶链反应 （PCR） 授课：曹英林 山东大学医学院免疫所 2005-10-21 1、PCR有关概述 发展简史 基本原理 影响因素 标本制备 常见问题与对策 用途 　 　　　 　　 2、常用的PCR技术 RT-PCR (reverse transcriptine PCR) RTQ-PCR (real-teme quantitative ，RT-PCR) Long accurate PCR(long DNA fragment) RP-PCR(recombinant PCR,RP-PCR) Multiplex PCR Asymmetric PCR 3、PCR的主要应用 制备cDNA文库 分离、扩增DNA、分析DNA(基因） 医学临床应用 其他 4、PCR技术特点 特点： 体外扩增DNA的技术 特异性较高 扩增效率高：pg　　 pg,ug,mg 应用范围广 假阳性率？ 5、学习掌握的要点： 经典PCR的基本原理 引物设计的基本原则 参与PCR反应的成分 RT-PCR、实时荧光定量PCR的原理 一、发展简史 Mullis:1980s，已有dideoxy sequencing. procedure,DNA template,DNA polymerase. Mullis: 1983年April发明PCR，1984年春科学年会报 告，1990年April发表于《美国科学》。 1993年获诺贝尔奖。 Sarki: 1985年将PCR用于镰刀红细胞贫血的诊断。 Erlich: 1986年分离纯化了耐热的TaqDNA聚合酶， 适用于PCR。 Saiki： 1988年利用耐热DNA多聚酶，进行PCR研究。 ——目前，PCR 已经是广泛应用于基因扩增和分析的主要技术。 二、常规PCR 原理 特点 反应条件 引物设计 影响因素 标本制备 常见问题及对策 一、常规多聚酶链反应 （一）基本原理： PCR是体外酶促合成特异ＤＮＡ片段的方法。由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的ＤＮＡ得以迅速扩增。扩增量：pg　　pg,ug,mg 　变性　 退火 　延伸 延伸　　 （二）PCR 的特点  操作简单：程序化、自动化 省时： 2-3 hr 灵敏度高：pg 特异性强 对原始材料质量：要求低 缺点：有一定程度的单核苷酸错误掺入 （三）PCR反应体系的组成 模板：DNA或RNA，用量（哺乳动物基因组/0.1-1 ?g; 细菌或 质粒DNA/pg-ng) ；模板要求不高（无交叉污染 达蛋白质）。 引物：直接决定PCR的结果，必须保证PCR反应能准 确、特异、有效地扩增模板。 引物浓度：0.1-0.5 ?mol/L为好 缓冲液：10-50mmol/L Tris-HCl， （Ph8.3-8.8） Mg2+浓度：1.5-2 mmol/L dNTP： 单核苷酸浓度 50-200 ?mol/L Taq DNA聚合酶：100?l 反应液中加入1-2.5U 的Taq DNA聚合酶。 （四）PCR反应的条件 ℃ 变性温度与时间： 94-95℃，30s 复性（退火）温度：温度低于Tm值5℃ Tm=4（G+C）+2（A+C） 复性时间： 时间为30s-1min 延伸温度与时间： 72℃ 30s-1min 循环数： 30-35 （五）PCR引物的设计 基本原则： PCR的技术关键：引物的特异性 两端引物： 5’引物（上游引物，与模板序列相同） 3’引物（下游引物，与模板序列互补） 引物长度：一般为15-30bp PCR引物的设计原则： *１.上游引物：与目的DNA５’端序列完全相同； 下游引物：与目的DNA３’端序列互补 *２.引物长度：以15-30个碱基为宜（最佳长度 20-24bp)；引物碱基尽可能随机分布，G+C 含量为45-55％ *３.避免引物内形成二级结构(尤其发夹样结 构） *４.两引物间不应发生互补，特别是在３’ 端， 避免形成引物二聚体 *5、两引物间不应有同源序列，与模板DNA的 其它序列也不应有同源序列 *6、引物3’末端碱基,与模板DNA一定要配对 7、合成的引物应进行纯化 8、引物的浓度不要太高: 0.1-0.5 ?mol/L