010HIV筛选试验的原理.ppt

HIV筛选试验的原理、方法、应用及其质量保证湖南省临床检验中心 吕岳峰 第 四 章HIV筛选试验原理 一、献血者HIV筛选 1、最安全的献血者应具备的条件——健康 在考虑献血者筛选HIV的特异性筛选检测方法时，应该记住安全供血取决于健康的献血者。 最安全的献血者：固定的、志愿的、无偿的。 2、献血者HIV筛选的意义 ①防止HIV的传播 ②防止其它传染病原体的传播 ③节约人力、财力 二、试验原理 用于检测HIV抗体基本筛选方法主要有三种： 1、酶联免疫吸附试验(ELISA/EIA) 2、颗粒凝集试验 3、特异性快速试验 在选择最恰当的方法使用时，需考虑的一些特性： ※试验的原理 ※复杂性 ※反应时间 ※敏感性 ※特异性 ※不同情况下的适用性 ※有效性 ※费 用 这三种试验都基于相同的生物学原理，并包含相同的两大基本步骤： 1、样品中特异性抗原或抗体的存在是通过其与包被的抗体或抗原结合，形成抗原抗体免疫复合物而完成标准的免疫学反应来证明的。 2、免疫复合物形成后由指示系统来检测。 ●术语： 在我们仔细研究检测方法之前，先弄清在表述筛选结果时下列术语的用法： ※阳性/阴性 ※反应/无反应 ※可疑 “阳性”和“阴性”只能用于描述献血的初次试验结果被一次或多次检测进一步确证后的结果。在被确证前，实验结果应被定为“反应”或“无反应”。实际上，对无反应的筛选结果一般不再进行进一步研究，仅对有反应的结果进行确证。 WHO术语中称一个不能被明确地划分阳性或阴性(通常处于Cutoff值周围)的结果为可疑(不确定)。 三、酶标免疫技术EIA(ELISA) EIA有多种形式，既可用于检测抗原也可用于检测抗体。一般来讲，最简单常用的检测HIV抗体方法是利用固相抗原捕获样品中特异的HIV抗体。 根据固相抗原的不同来源试剂盒分四代：第一代使用的是纯化的或未经纯化的天然病毒或是被病毒感染细胞培养后的细胞溶解产物。第二代使用重组抗原，它通过将病毒核酸片段整合到酵母菌内，经基因工程使该酵母菌大量扩增，再纯化病毒蛋白质等步骤获得。第三代使用通过化学合成法人工合成的病毒多肽。 目前已有第四代试剂盒,它是在第三代试剂盒的基础上增加了P24抗体,故能同时检测HIV抗原和抗体. 这里介绍两种反应原理相同，但抗原包被的方法不同的EIA ： 1、包被微孔（聚苯乙烯），即通常所见的96孔板,简称微孔法。 2、包被小珠（聚苯乙烯小珠），小珠直径约4mm：即通常所见的20/60孔Abbott小珠,简称珠法。 下面先介绍微孔法： 它可分三种类型： ※抗球蛋白型EIA：这是EIA的最简单形式，样品中的病毒抗体与固相病毒抗原结合，然后通过酶标抗人球蛋白抗体被检测。 ※竞争型EIA：这一方法稍微复杂些，标本中可能存在的天然抗体与酶标记的特异抗体竞争固相抗原上的结合位点。 ※夹心型EIA：这是一种高特异性的EIA法，标本中的病毒抗体与固相抗原结合，然后通过结合的酶标记抗原被检测。 第一种：抗球蛋白型EIA方法学(HIV抗体筛选) 1、包被：抗原吸附于微孔板表面形成固相抗原的过程(见图12) 各孔中加入含抗原的碳酸氢盐缓冲液，放4℃孵育12-16小时，因制造微孔板的塑料能够结合蛋白质，便完成包被。孵育后，弃去抗原溶液，用蒸馏水或特殊性缓冲液洗涤，并使之迅速干燥。保存在4℃，放置很长时间也不会有抗原丢失。通常这些板由生产商包被和标化后提供。 2、加样和孵育：血清或稀释后血清加入孔中，或者血清加入已包含稀释液的孔中，它们在限定的时间和准确的温度下温育，温育时间可以30分钟至2小时，温度可以18-45℃。每块板上设一定数量的阳性和阴性对照孔，以及低值阳性对照。在这段时间内，测试血清中存在的特异性抗体与病毒抗原结合。(见图13) 3、洗板：洗去孔内的游离血清(见图14) 4、加酶标记物和孵育(见图15） 5、洗板（见图16) 6、显色 (见图17) 7、加稀酸溶液终止反应。 8、读取微孔中溶液的吸光度（光密度）值（OD值），并判断试验的结果。 第二种：竞争型EIA方法学（HIV抗体筛选） 竞争型EI