western-blot条带分析及解决方法摘要.docVIP

现象 原因 解决 反影(白色条带,黑色背景) 1 HRP过高(背景较高) 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1 显影后膜上条带处变为黄色 2 HRP过高(敏感性太高) 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2 信号弱或无 3 HRP过高引起底物迅速耗竭 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3 4 抗体-抗原系统敏感性过低 提高抗体浓度/蛋白上样量*注4 5 转膜不充分/过转 优化转膜条件*注5 6 HRP或底物活性降低 测试活性或选用敏感底物 *注6 高背景 7 HRP过高(背景较高) 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7 8 封闭时间不足 延长封闭时间4度过夜最好*注8 9 抗体与封闭液有交叉 更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9 10 TBST洗脱不足 增加洗脱时间、次数、用量*注10 11 暴光时间过长 降低暴光时间*注11 12 抗原-抗体浓度过高 降低抗体浓度或蛋白上样量*注12 条带内无显影的白点 13 转膜不良（如有气泡在胶-膜之间) 精细操作*注13 14 膜平衡不均/油脂污染 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14 15 膜与X光片间有气泡 显影前去除气泡*注15 非特异性条带 16 抗体交叉反应 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16 17 SDS非特异性结合蛋