ELISA实验技术.pptx

双夹心法酶联免疫吸附在生物样本分泌型蛋白定性/定量中的应用广州医科大学梁 雪酶免疫测定技术概述酶免疫组化均相酶免疫测定酶免疫测定液相酶免疫测定直接法间接法夹心法竞争法异相酶免疫测定固相酶免疫测定ELISA1.酶联免疫吸附测定类型酶免疫技术概念 酶联免疫吸附测定法 （ELISA），指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性/定量方法。间接法直接法substrate用于检测小分子抗原用于检测抗体12substrateenzyme-labeled antibodyenzyme-labeled antibodyAntibody in sampleCoating antigenCoating antigen in samples竞争法夹心法substratesubstrate用于检测大分子抗原用于小分子激素、药物43enzyme-labeled antibodyAntigen in sampleenzyme-labeled antigenAntigen in sampleCoating capture antibodyCoating capture antibodysubstrateStreptavidin bridges将抗体吸附到固相载体上封闭Biotinylated enzyme molecules加入待检样品以及后续试剂孵育洗涤去掉游离未结合的反应物Biotinylated antibody加入酶检测底物Coating capture antibody结果的判读2.技术原理EEEESSSS2.技术原理生物素-亲和素生物反应放大系统 生物素易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了生物素分子的特异性抗体，与结合了酶（如：HRP）的亲和素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物（如：TMB）时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。ESHRP+ 2H2ODDH2+ H2O2TMBBiotinylated enzyme moleculesHRPStreptavidin bridges反应条件的选择主要试剂及材料操作的标准化3.夹心法测定技术要点技术要点主要试剂及材料固相抗体eg. Capture antibody -- Mouse CXCL1/KC MAb (RD system)标准品eg. Standard--Recombinant Mouse CXCL1/KC Protein 结合物抗体eg. Detection antibody -- Mouse CXCL1/GRO alpha /KC/CINC-1 Biotinylated Antibody酶 eg. Streptavidin-HRP主要溶液 固相载体 溶液名称保存条件保质期说明1×PBS室温3个月固相抗体包被液1×PBST室温两周洗涤液0.05-0.5%BSA4℃两周封闭液Assay buffer4℃两周抗体/标本稀释液TMB显色液室温20分钟H2O2:NaAc:TMB=5:4:12N H2SO4室温3个月酶反应终止液固相载体性能的检查：样本10ug/L IgG 包被，加酶标抗IgG ，显色后，测20孔的OD，要求CV＜10%返回上一级反应条件的选择EEEEESSSSS彻底清除非特异性结合的HRP酶将抗原稀释至合适浓度封闭时间1~2h返回上一级操作标准化加样 1 加样要加到孔底，但移液枪头不能接触孔底 2 不可溅出或产生气泡 3 标准品等比稀释的操作规范洗涤 1 洗涤次数适当 2 移液枪头悬空于孔上方 3 洗涤后孔内洗液尽量弃净比色 1 双波长法 样本OD= OD450nm-OD630nm4.实验对照的设定空白对照 例如：用PBS代替样品阴性对照 检验试剂有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 例如：用标本/抗体稀释液代替样品阳性对照 检验试剂有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 加入量应与试剂敏感度相称 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，定量标本待检抗原。阴性对照阳性对照候选药物对烟草烟雾提取物诱导的IL-6分泌的影响5.实例分析样本的收集与保存 正常对照组16HBE细胞；经CSE刺激的16HBE细胞；经CSE刺激并给予候选药物干预的16HBE细胞。于CSE刺激12h后收集三组样品细胞上清液。包被固相抗体 4℃孵育过夜封闭加样及标准品 各组细胞上清液；人IL-6标准品冻干粉，按说明书等比稀释成8个孔，绘制标准曲线。加生物素化的检测抗体—HRP—TMB—终止反应结果分析标准曲线拟合度分析反应了操作的规范性；整套反应系统的可靠性。 ODpg/ml2.3282432001.3196731000.729178500.43031925050.1623186.250.12