荧光计数法.docVIP

操作步骤： 取1mL发酵液于9mL的0.85%生理盐水中震荡、悬浮。 避光条件下，取1mL悬浮液，分别加入100μL的PI染料和100μL Super Green I染料，摇匀，避光放置15min. 用孔径为0.22μm的黑色聚碳酸酯滤膜? 一、荧光染料PI（碘化丙啶） ? 二、PI(Principle Investigator的缩写) 一、荧光染料PI（碘化丙啶） PI分子结构 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide，分子式为C27H34I2N4，分子量为668.40。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。常用于流式细胞仪分析和显微镜观察，检测细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)。 保存条件：?4避光保存。?注意事项：?1.?对人体有刺激性，请注意适当防护。?2.?为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 PI-dsDNA复合物的激发光和发射光波长 PI荧光染料 细胞核荧光染料PI碘化丙啶（简称PI）是一种常用的细胞核荧光染色剂。它不能透过完整的细胞膜，但PI能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，PI在绿色光（540nm波长）的激发下，会在600nm（红色光）处发出明亮的荧光，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍无毒核酸电泳染料SUPER Green I使用方法 来源:生物谷 时间: 2010-5-24 浏览人数: 1646 ?? SUPER Green （10,000× DMSO溶液，电泳级） SUPER Green 核酸染料特点 ●? 无毒性：属花箐类染料，容易生物降解，无致癌毒性。 ●? 灵敏度高：至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25～100倍。 ●? 信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。 ●? 操作简单：无须脱色或冲洗，即可直接用紫外凝胶透射仪或可见光透射仪观察。 ●? 适用范围广：可适用于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳、脉? ????冲电场凝胶电泳和毛细管电泳等。 ●? 使用方便：对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、反转录酶、内切酶、T4连接酶 ??? 等）没有抑制作用。 ● 经济：价格比银染便宜。 SUPER Green 使用方法简介 1．胶染法（用法同EB）?? （推荐方法，见图1） （1） 制胶时加入SUPER Green I 核酸染料。冷却胶至50左右，每100mL胶中加入3～5μL SUPER Green I 核酸染料。 （2） 按照常规方法进行电泳即可。 u? 注：此方法染色可以准确确定片段分子量，用量相对较少。1mL染料大约可以做300块100mL的胶。 2．点染法 （见图3） （1） 该方法适于琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳。 （2） 工作液的配制：用电泳缓冲液将10000×的SUPER Green 稀释100倍，即为SUPER Green 工作液。SUPER Green 工作液可以置2～8保存一个月以上。 （3） 制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。 （4） 样品染色：向分析样品中加入SUPER Green 工作液和载样缓冲液，室温 放置10分钟，使SUPER Green 与样品中DNA充分结合。SUPER Green 工作液加入量为总上样量的1/10。 （5） DNA Marker染色：将5μL DNA Marker和5μL DNA Marker稀释液和1μLSUPER Green 工作液混匀，室温放置5分钟，使SUPER Green 与DNA充分结合。 （6） 上样、电泳：按常规操作。 u? 注：用点染法染色时，灵敏度最高，染料用量最少。但大片段稍有滞后现象，如果需要更准确确定分子量（与Marker相比），建议使用胶染法。 3．泡染法 （1） 按照常规方法进行电泳。 （2） 用PH 7.0～8.5 的缓冲液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000﹕1的比例稀释SUPER Green浓缩液，混匀，制成染色溶液。 （3） 将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10～30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝胶直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均匀地覆盖整个胶板，并染色30分钟。玻璃平皿必须预先经过硅烷化溶液