实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量.ppt

722 型分光光度计的使用及注意事项 插上插头，接通电源，打开暗箱盖，预热20min。先在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。 然后盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100， 注意：分光光度计在接通电源而不用时，必须打开暗箱盖，以免光电管老化。 暗箱 将准备好的试剂倒入比色杯中，用吸水纸擦去比色杯外侧水珠，并依次放入比色杯架中。 注意：手拿比色杯毛面，试剂倒入杯中满3/4 即可。 接通电源，打开仪器电源开关，打开样品室盖，预热20min; 将空白液或对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用擦镜纸擦净外壁，放入样品室内, 空白液一般放于最外格，样品比色杯放入位置与试管位置对应; 调好波长; 调节按钮 开盖时，调 T 参数 调为 100 合上盖，调 A 参数 调为 0; 逐步拉出样品室拉杆（听到“咔”一声），读取吸光度值(A）; 读数完打开样品室盖，再将读数写入记录本。 样品室盖应轻开轻放； 比色皿拿其磨砂面，液体装入约3/4高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上； 倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； 每调换一次波长，都应将空白溶液的吸光度调至“0”。 预祝同学们实验成功! * 考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香氨基酸残基结合. * 在595nm下测定的吸光度A595,与蛋白质浓度成正比. 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量 蛋白质含量的测定 微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法） 实验类型——基础验证型 实验目的 掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的基本方法。 一 原理 考马斯亮蓝G-250染料 酸性溶液中 与蛋白质疏水区结合 465nm 棕红色 青蓝色 595nm 在一定蛋白质浓度范围内(1-1000ug)，蛋白质和色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 简便快捷，灵敏度高，稳定性好 二 试剂、材料与设备 2.1主要试剂 1 标准蛋白质溶液的配制： 牛血清白蛋白(BSA) 10mg 定溶于100ml 0.9%NaCl溶液 100μg/ml的标准蛋白质溶液 2 考马斯亮蓝G-250试剂的配制： 考马斯亮蓝G-250 溶于50ml 加100ml 蒸馏水定容至1L 100mg 95%乙醇 85%的磷酸 3 样品液的准备： 某蛋白质 配制成一定浓度的样品液 用0.9%NaCl溶液 2.3 主要仪器 722分光光度计 漩涡混合器 移液器 移液管 烧杯 吸耳球 擦镜纸 试管 三 实验方法 3.1 标准曲线的绘制 取7支试管按下表操作，混匀，静置3min，在595nm下比色，1号管为对照管，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度作为横坐标作图得标准曲线。 试剂 1 2 3 4 5 6 7 100μg/ml标准蛋白质(mL) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.9% NaCl溶液(mL) 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝G-250染料(ml) 4 试剂 1(空白 ) 2 3 4 5 6 7 标准蛋白液/mL 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.9%NaCl/mL 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝染液/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质浓度(μg/mL) 0 10 20 40 60 80 100 A595 3.2 样液的测定 干 净 试 管 1ml样品液 4ml染液 混匀 静置3min 595nm 读取吸光度，反查标准曲线 四 注意事项 移液管的正确使用 分光光度计的正确使用 移液枪的正确使用 五 思考题 测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理有哪些不同？ 移液枪的使用方法 量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项 移液枪的结构 吊钩 手柄 枪杆 移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器 数字显示器 1.量程的调节 ！！看清量程再调节