图像分析201410.ppt

第七章 组织化学与免疫组织化学定量分析技术 显微图像分析 流式细胞术 激光扫描共聚焦显微镜技术  第一节、显微图像分析 显微图像分析系统组成 image analysis system 基本术语和常用测量参数 像素 灰度 色彩 长度 面积 光密度 像素 灰度 指图像每一像素的明暗（深浅）程度，即该像素的图像由黑到白变化的量化等级。 荧光照片 荧光照片本质上是单色图片。一般只有一种颜色。所以拍摄荧光照片时，最正规的方法是拍摄灰度图片。 色彩 伪彩色图像（假彩色图像）：根据灰度值人为地设定不同的颜色。 真彩色图像：是由图像采集装置将每一像素的真实色彩分解为红、绿、蓝三种原色信号，每种原色信号又有其灰度等级，最终再通过计算机重新编码还原为彩色图像。 例1：甲状腺模型 长度 面积 图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。 统计分析 结果输出 吸光和发光组织样品的常用测量参数 吸光组织细胞样品的测量 积分光密度 又称积分吸光度，是被测量范围内各像素吸光度的总和，表述测量范围内各像素吸光物质的总含量，测量范围可为面积或体积。 平均光密度 又称平均吸光度 ，是被测量范围内各像素吸光度的算术平均值，表述被测量范围内各像素吸光物质含量的平均水平，可反映此范围的染色深浅程度。反映被测量范围内各像素染色深浅差异的指标，称为平均光密度方差，是表述被测量范围内各像素间吸光度的离散程度。 发光组织细胞样品的测量 积分光强度 被测量范围内各像素光强度的总和，表述测量范围内各像素发光物质的总含量，测量范围也可为面积或体积。 平均光强度 被测量范围内各像素光强度的算术平均值，表述被测量范围内各像素发光物质含量的平均水平，可直观地反映此范围的亮度。反映被测量范围内各像素间亮度强弱差异的指标，称为平均光强度方差，表述被测量范围内各像素间光强度的离散程度。 每次均在开机20分钟后，在40倍物镜下采集图像。从每张切片中选取一有代表性区域， 连续取 20 个高倍视野（×400 倍） 分别对免疫组化染色胞浆中的阳性表达进行定量分析，计算每视野阳性染色的光密度（OD）值和积分光密度（iOD）值，并取 20 个视野的积分光密度之和。 显微图像分析处理程序 制作切片样品 获取图像 在计算机屏幕上显示的数字化显微图像 较暗的背景值对分析结果的影响 扣背景后依然没有显著性差异 图像分割 将图像中需要测量的目标从背景中分割出来 测量 统计分析 结果输出 计数阳性细胞数 显微图像分析应用中的注意事项 设计在先，测试在后 明确需要测量分析的对象 实验操作过程的一致性 图像分析系统输入条件的一致性 图像分析系统现有参数的局限性 二维定量信息的局限性 图像获取的标准化是指将在图像输入过程中保证设备参数的一致性。设备参数包括图像尺度(即放大倍数)、光源亮度、图像空间分辨率、图像格式等。在输入过程中, 应分别根据感兴趣区的大小和灰度(或颜色亮度) 确定图像尺度和光源亮度。 图像处理的目的是改善视觉效果, 突出感兴趣区, 便于进行进一步的图像分析。此外, 免疫组化染色会产生一定的背景色, 即非感兴趣区会有一定程度的染色, 这会对后期图像分析造成影响。在图像处理时, 应在图像中减去背景色, 将本底灰度设为零, 为此可对图像进行进一步的校准。 总结拍摄注意事项： 调整显微镜光源亮度(电压9伏)，足够白，足够亮。 调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。 确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。 使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件(曝光及白平衡设置)一次拍摄完所有照片。 保存照片为TIFF格式。象素不必太大。 优点 首先, 图像处理方法可以进行精确的定量分析, 能够将切片图像中目标的细微差异反映出来。 其次, 计算机分析可以对整个视野图像进行分析, 使得短时间内处理大量切片图像成为可能, 从而增加了处理样本的范围, 提高了结果的准确性和可信度。 计算机分析方法可以大大减少分析过程中的人为因素影响, 保证了分析结果的客观性。 在正规的场合下，并不认可使用荧光照片进行强度测量。这是因为，荧光照片的亮度与荧光照明与曝光密切相关。特别是由于荧光染料的淬灭效应，使得我们在拍摄荧光照片时，很难保证对所有样品加上完全相同的拍摄条件。就是说，荧光照片并不能准确地反应实际的荧光强度。这种“不准确”程度相当大。潜台词就是，荧光照片的强度太容易作假了. 拍摄灰度图片的好处是可以记录更高的位深。这样亮度细节更细致。事实上，当今广泛使用的激光共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光