现代分子生物学第五章.ppt

LR反应： 将目的片段从Entry 载体中重组入表达载体。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点，目的载体上含有attR1和attR2位点，在重组蛋白的作用下发生定向重组，形成新的位点attB1和attB2，将目的基因转移到表达载体中。 5. 5. 4 基因的图位克隆法（Map-based cloning） 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。 通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 通过对不同的生态型及限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记，通过染色体步移法将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来，根据基因功能互作原理鉴定目的基因。 图5-26 染色体步移法克隆基因示意图 在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cM（厘摩）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cM≈1000kb；拟南芥菜中，1cM≈290kb；小麦中，1cM≈3500kb。 用图位克隆法获得水稻脆杆基因BCl 将BCl定位于水稻3号染色体（Chr3）分子标记C524a和RM16之间； B. 覆盖BCl位点的BAC大片段。 C. BCl位点的精细定位。BCl位点被定位于分子标记P2和P4之间与P3共分离。 D. BCl基因结构。红色为编码区，白色为5’和3’非翻译区，黑色线段为内含子。bcl-1和bcl-2表示两个突变位点。 5. 6 蛋白质与蛋白质组学技术 蛋白质组学是蛋白质（protein）和基因组（genome）研究在形式和内容两方面的组合，该技术致力于研究某一物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。 蛋白质组与基因组既相互对应又有显著不同，基因组是确定的，每个个体只有一个基因组，而基因的表达调控水平（蛋白组）却会发生显著的变化。 由于蛋白质分离（双向电泳和高效液相层析技术）和鉴定技术（现代质谱）的进步，以及基因组学和生物信息学的交叉渗透，蛋白质组学研究在已经获得了长足的发展。 5. 6. 1 双向电泳（Two－Dimensional Electrophoresis，2-D）技术 等电聚焦（Isoelectric focusing，IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）双向电泳技术。蛋白质是两性分子，在不同pH缓冲液中表现出不同的带电性，因此，在两性电解质电泳体系中，不同等电点的蛋白质会聚集在介质上不同的区域（等电点）从而被分离。 蛋白质的分子量决定了SDS-蛋白复合物在凝胶电泳中的迁移率，因为聚丙烯酰胺凝胶中的SDS带有大量的负电荷，与之相比，蛋白质所带电荷量可忽略不计。因此，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于其分子量。 用2-D胶展示拟南芥种子萌发48h后的蛋白质表达 5. 6. 2 蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting）：是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种可靠方法。主要分为 a、蛋白样品的制备；b、SDS分离; c、转膜载并封闭膜上未反应位点，减少非特异性吸附；d、与相应非标记抗体（一抗）反应；e、洗去多余的一抗，加酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。 免疫印迹 （Western Blotting）示意图. 图5-30 用辣根过氧化物酶显色法和抗GFP的抗体检测外源TLR3-GFP融合蛋白在同一细胞系不同克隆株中的表达 （1，2，3，4表示不同的克隆株）。 5. 6. 3 蛋白质的质谱分析技术 现行质谱仪主要有三个连续的组成部分，即离子源，离子分离区和检测器。 较常用的有基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight spectrometry，MALDI-TOF）和电喷雾质谱（Electrospray ionization，ESI-MS）。 MALDI-TOF的工作原理：将蛋白质酶解成小肽段后与基质（主要是有机酸）混合，将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶，然后用激光轰击，将呈离子化气体状态的待分析物从靶表面喷射出去。离子化气体肽段在电场中被加速后到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值（m/z）决定。 图5-31 MALDI–TOF分子质谱仪原理图 图5-15 cDNA合成过程示意图。 图5-16 定向cDNA 合成及分子修饰 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。 cDNA文库的构建 cDNA的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。