第2章 DNA复制.ppt

图2-9 E-coli OriC复制起始过程 首先，DnaA与OriC处的识别位点（9bp重复序列，图2-9）紧密结合，形成起始复合物，通过DNA的弯曲，使DnaA与A-T富含区相接触，使其解链，形成开放复合物，单链结合蛋白（SSB）与解开的单链结合。 DnaA还能指导DnaB-DnaC复合物结合到解链区形成前引发复合物，DnaC的唯一功能是运送DnaB蛋白，DnaB具有螺旋酶活性，使超螺旋解旋，暴露出引物形成位点，DnaB同时引导引物酶DnaG的结合形成引发复合物，合成RNA引物。 Hu因子的作用是促进起始复合物的形成，因螺旋酶能松弛正超螺旋，促进双链解开。 以上复合物的形成和解链两个阶段都需要ATP的存在。 大肠杆菌质粒的复制起始中，有些需要宿主DnaA和质粒本身编码的复制蛋白共同作用。 3.SV40 DNA复制的引发 真核生物的复制比原核生物要复杂得多，基因组大，复制速率慢，需要多个复制起始位点。对真核生物复制起始的认识，是从认识SV40开始的。 SV40 DNA的复制过程比E.coli要复杂的多，但由于其基因组小，也仅有一个复制起始位点。 SV40体外复制实验证明，至少需要8个蛋白质或酶的作用，才能完成复制。这8个组分分别是T抗原、拓扑异构酶Ⅰ或Ⅱ、复制因子A（RFA）、复制因子C(RFC)、增殖细胞核抗原（PCNA）、DNA聚合酶?-引物酶复合物、DNA聚合酶?等。 T抗原先形成多亚基复合物，在ATP存在下，与SV40 Ori区结合，利用它的3’-5’螺旋酶活性, 在Ori区引起DNA解旋解链，在RFA和拓扑异构酶协同作用下，形成前引发复合物，促使DNA进一步解旋解链，并与DNApol?-引物酶结合形成引发体,Pol ?中的引物酶亚基起始RNA引物合成（图 2-10）。 图2-10 SV40 DNA复制的起始 4.真核细胞DNA复制的引发 前复制复合物的组装和激活 真核细胞染色体DNA的复制是细胞分裂期间一个重要的生理过程。在真核生物中，存在一种保守的机制，使染色体DNA的复制仅发生在细胞周期的S期。这种保守的机制被称为“允许机制”(licensing mechanisms)。 首先，在复制起始位点形成前复制复合物（pre-replicative complex,Pre-RC）。 其次，Pre-RC被激活，从而启动DNA的复制，并防止一个细胞周期中复制的再次发生。 最后，Pre-RC的激活主要依赖于两种促S期激酶（S phase promoting kinases）,这两种促S期激酶在真核生物中是保守的。那么Pre-RC是怎样被组装和激活的呢？ 在体外，蟾蜍卵提取物可以启动DNA模板的复制。在复制起始前，蟾蜍的ORC、Cdc6和MCMp都与染色体复制起始位点相互作用，它们是复制起始所必需的。 免疫消耗试验结果表明，蟾蜍Cdc6结合染色体，需要Orc2的存在，而Mcm3结合染色体则需要Cdc6的存在。但是Orc2结合染色体并不需要Cdc6。 用免疫共沉淀试验，可以发现在复制起始位点有Cdc45和MCMp的复合物，这说明Cdc45也参与Pre-RC的组成。 那么Cdc45是如何组装到复制起始位点的呢？目前，其分子机制还不是很清楚。 有研究结果表明，Cdc45蛋白在细胞周期的G1期可以与染色体复制起始位点相互作用，并且是依赖于CDK和MCMp的。 Cdc45结合复制起始位点后，可以促进DNA聚合酶α和ε、复制蛋白A以及增殖细胞核抗原等多种参与复制的蛋白与染色体相互作用。以上结果表明，在染色体复制起始位点上，Pre-RC的组装是按ORC、Cdc6/Cdc18、MCMp、Cdc45的顺序依次进行的（见图2-11）。 图 6-11 真核细胞复制起始的引发 2001年6月《Science》报道，加州大学科学家发现激活Clb-Cdc28蛋白激酶可以起始DNA复制（S），并且通过作用于三个目标分子（ORC，Cdc6和Mcm2-7）从而防止第二轮复制的发生。有丝分裂期（M）之后激酶的失活可以带来新一轮的复制。 当细胞分裂时，要求DNA复制严格控制。事实上，这种控制和遗传稳定性的失败会导致细胞死亡或者甚至导致癌症的发生。目前发现Clb-Cdc28在控制DNA复制方面发挥双重功能。当细胞分裂开始时，一组名为前复制复合物（pre-RC）的蛋白质聚集到DNA合成开始的众多复制起始位点的每一个上。一旦组装完成，pre-RCs做好准备起始DNA复制，但是在细胞突然激活Clb-Cdc28激酶之前不会开始复制工作。这时候这种酶表现出其多能性。