第3章蛋白质工程.ppt

二、t-PA的基因工程 下面描述t-PA基因工程的步骤和方法。 1.获取目的基因 获取目的基因的方法很多。对于大多数已知基因，借逆转录酶，以mRNA为模板，进行酶促合成相应的cDNA，是获得真核细胞基因最主要和最常用的方法。 t-PA基因可用此法获得。 （1）搜索t-PA mRNA序列 ①登陆美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站，在Search栏中键入nucleotide，在For栏中键入 human tissue plasminogen activator mRNA，点击Go； ② 网页上会出现许多搜索结果，选择 A03776 H.sapiens mRNA for tissue plasminogen activator (t-PA)，即可得到t-PA mRNA全长序列。 （2）提取总细胞RNA Bowes黑色素瘤细胞能大量合成t-PA，因此也可以高频率地合成t-PA mRNA。 体外大量培养Bowes黑色素瘤细胞，应用TRIZOL法提取总细胞RNA。 （3）cDNA合成 在逆转录酶的作用下，采用oligo（dT）引物，以总细胞RNA为模板，合成cDNA的第一条链，得到DNA-RNA杂合分子，随后采用RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶I和T4 DNA Ligase 联合作用，以单链cDNA为模板合成双链cDNA。 （4）以PCR方法获取t-PA基因 根据t-PA mRNA 5`和3`端的核苷酸顺序，设计一对PCR引物。在两条引物中分别设计AvrII和NotI限制性内切酶位点。 以获得的cDNA为模板，加入引物、耐热的Taq酶、dNTP和缓冲液后，PCR扩增t-PA基因。 2.t-PA基因的体外重组与测序 以AvrII和NotI酶解t-PA基因和pUC19质粒，在T4 DNA连接酶的作用下，将t-PA基因与pUC19质粒重组，转化大肠杆菌JM109，应用蓝白斑法筛选阳性克隆。 为了保证所获基因的准确性，必须对其进行DNA序列测定。现有许多生物技术公司能够提供测序服务，快捷方便且价格合理，为大多数实验室所采用。 3.表达载体的构建与转染 应用AvrII和NotI酶解阳性克隆的重组质粒和表达载体pPIC9K，将分离的t-PA基因与pPIC9K相应位点重组，构建t-PA表达质粒。 电转化大肠杆菌JF1125，再应用上述两种酶进行酶切鉴定，筛选出重组的阳性克隆。 4.t-PA表达载体转化酵母 SalI将构建成功的阳性表达载体线性化，电穿孔转化甲醇营养型酵母Pichia pastoris GS115，t-PA cDNA通过同源重组与酵母染色体整合，筛选多拷贝的转化子，PCR验证t-PA cDNA与酵母染色体的整合状态。 5.t-PA基因在甲醇营养型酵母中的表达 挑取数个多拷贝转化子，并以转入空载体的GS115转化子作对照，接种于含甲醇的培养基中培养，每两小时取样，电泳分析t-PA表达水平，培养时间3-5天。 6.纯化 （1）浓缩脱盐：将离心所获的上清经微孔过滤后，应用超滤法浓缩脱盐。 （2）凝胶过滤：用Sephadex G-50凝胶过滤层析柱纯化，去除小分子杂质如核酸、杂蛋白、残留无机盐、甲醇等。 （3）离子交换：纯化后的样品用SP-Sepharose FF离子交换层析柱进一步纯化。 通过以上的纯化步骤，一般可以得到纯度95%的t-PA蛋白。 此后，研究者在两个反平行的螺旋间加了环区，并根据第一步的结果对螺旋进行了一些修改。 环区开始是用单个Pro与两个螺旋的终结者Gly构成Gly-Pro-Arg-Gly的连接区，结果发现产物成了三聚体（含6个螺旋）而不是期望的二聚体（4个螺旋），后来将连接的环区改成Gly-Pro-Arg-Arg-Gly才得到二聚体。 第三步，在二聚体之间加了第三个连接体，用的仍是Pro-Arg-Arg，这个肽共74个残基。最后，他们合成了该多肽的基因，在E.coli中实现了表达。这项工作被誉为蛋白质分子设计的里程碑。 后来Richardson等也设计了四螺旋捆，称为Felix（意为four helix），79个残基，由非重复序列组成，并在1～4螺旋间加了一个二硫键。 设计目标除了α-螺旋外还有β-折叠。 β -折叠比α-螺旋要困难一些，后者主要靠局域性的氢键就可以设计出来，而前者却涉及了序列上靠近或不靠近的不同股之间的氢键。著名的是Betabellin（Beta barrel bellshaped protein），是由前后两个β－折叠组成，每个折叠由四股组成。 随着理论和技术的发展，人们又把目标瞄向α/β混合蛋白质，以及进一步优化已