2.11基因工程制药-变性蛋白的复性要点.pptVIP

呼伦贝尔学院 高 明 华 基因工程制药 变性蛋白的复性 第十一节 变性蛋白的复性 以大肠杆菌作为表达系统生产基因工程药物时,药物 蛋白通常会形成无活性的蛋白聚体即包含体,它们的 一级结构即氨基酸序列是正确的,但空间结构错误, 没有生物学活性。需要一个复性过程才能得到生物 活性蛋白。 包含体是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。 包含体的优势： 1. 富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势； 2. 抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解； 3. 对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。 一、包含体形成的原因 主要是高水平表达的结果。 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形成。 重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。 包含体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、 RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状 或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5- 1微米，无定形，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐 酸胍等。 二、包含体的分离和溶解 1. 包含体的分离 收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；使用变性剂 洗涤沉淀。 2. 包含体的溶解 打断包含体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使 多肽链伸展。 溶解采用强的变性剂，如脲、盐酸胍或硫氰酸盐， SDS，各种溶解方法都各有利弊。 含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、 二硫苏糖醇等。 加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。 三、包含体蛋白复性方法 几个 要求： 活性蛋白的回收率高； 正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离； 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品； 折叠复性方法易于扩大； 复性过程耗时少。 1、稀释、透析复性法 蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体 和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困 难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。降低 蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。 方法：在复性前用使用稀释、透析、过滤及凝胶过滤 除去变性剂、还原剂。将变性蛋白连续缓慢的加入到 复性缓冲液中。复性中通过透析逐渐减少透析缓冲液 中的变性剂浓度。 复性缓冲液的pH要远离等电点；离子强度不易过高，10-50mmol/L，离子强度太高蛋白质易发生沉淀，也不利于离子交换层析的分离；复性液温度不易过高在4℃-10℃较合适，对于耐热蛋白也可以室温复性；复性时间，以天然表达的重组蛋白复性应在6h以上。 蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。 稀释复性方案如下： 8M尿素变性，37 ℃ 2h。 50mM Tris pH8.0 ，50mM NaCl，1mM EDTA 1% Gly，10%甘油复性，1/100稀释复性，1%蛋白，室 温过夜，16h。 DEAE柱富集，新胶上柱后，用0.5M NaOH，8Murea， 洗脱蛋白。 2、含有二硫键的蛋白的复性 复性时涉及正确二硫键（分子内或者分子间）的重建。 ①空气氧化法； ②加入氧化剂-还原转换试剂； ③加入氧化型谷胱甘肽； ④使用还原剂保护巯基； ⑤加入二硫苏糖醇。 3、封闭蛋白的疏水簇促进复性 对蛋白质结构和序列的分析，确定出在蛋白中可能引起分子间相互作用的疏水簇。用特异性结合疏水簇的单克隆抗体来封闭疏水簇，减少分子间结合引起的聚集。 4、凝胶过滤层析复性 层析介质的隔离作用，降低了蛋白之间相互作用产生的聚集，使复性浓度、复性率得到很大的提高。 5、小分子添加剂促进复性 可以抑制蛋白聚集体的产生，可以稳定蛋白的活性状态，降低非正确折叠蛋白的稳定性等作用。 6、分子伴侣或折叠酶促进的复性 7、人工分子伴侣促进的复性 1、PBS或生理盐水洗涤菌体，Buffer?A重悬菌体，超声波破碎至清亮； 2、4℃ ，10000rpm离心10min，弃上清；  3、用PBS或生理盐水洗涤沉淀2-3次；  4、往沉淀中加?Buffer?A及20％的SKL（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置30min至２h；  5、4℃，10000rpm离心10min，取上清； 包含体蛋白复性的基本