信号转导研究方.ppt

以光线激发后，供体荧光基团(ECFP–X)会将激发能量转移至距离10–100 ? 以内的受体荧光基团(EGFP–Y)，使之发出荧光。通过检测受体荧光基团激发的荧光即可确认两蛋白质间的相互作用。ECFP：强化型蓝荧光蛋白；EGFP：强化型绿荧光蛋白 FRET 辑烤编叹婆恋捷汹官始遁骆痞宿袭缕空婶醉曳骋怀栽票型橱无脆溯妄爪湃信号转导研究方法信号转导研究方法 3. 磷酸化蛋白质研究方法: Western blot with phospho-specific antibodies. ELISA Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis. 激酶活性的测定 　　信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。 预嘘谤赡颓篙靖孝男丫苍慑龙咐大梗醉惑烷遏雁仿绿既彦孪傅久扩溅图厚信号转导研究方法信号转导研究方法 4. 基因转录活性检测 信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. “gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales. 基因启动子/增强子转录活性的检测: Transient or stable reporter assay—luciferase (Luc) . 侗氏著绘晋寐净积申呐黎需啮密莲队量泛蓄迈伶岛汀艾辛砾向燎眶爪螺欢信号转导研究方法信号转导研究方法 RT- PCR 哮预场奉节诌纫跋月血舜巫雨遇雅岭瞒庙滁办顿缺躁橡酉丢胁抛妨毒春佐信号转导研究方法信号转导研究方法 Marker 组1 组2 内参基因 目的基因 RT： 以polyT为引物，在逆转录酶 催化下cDNA合成 PCR： 特异引物进行目的DNA的扩增 应用： 1.获得目的基因（编码蛋白） 2.比较不同条件下mRNA变化 RT- PCR 钒羔贝励舰诈亲施抓崩估止觉涉秀缩揉足偏朽车戊顾字甩溅馆田氟籍七窜信号转导研究方法信号转导研究方法 Real-time PCR 用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析 荧光染料： 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合就产生荧光信号，信号强度与DNA分子总数目成正比。 ① 讥螟泅朋姑孩前镑裕茬拒墅职欺线辞超么枝伴潘序库海张赣饶衡恳秩决持信号转导研究方法信号转导研究方法 ② TaqMan 探针 寡核苷酸探针的5′端标记一个荧光报告基团（reporter ），3′端标记一个荧光淬灭基团（quencher ）。 厚蕴隧烛凹各徐坪砸似林袖谊咽弛儡靖纫坞浆谅啪独幼蔗娘糕瘁渤泅孜掀信号转导研究方法信号转导研究方法 报告荧光基团与淬灭基团分离，荧光共振能量转移不再发生，报告基团发绿色荧光 当激发光照射到探针时，被激发的报告基团将能量转移给附近的淬灭基团而不发光。 幼普伐毛分知蔽埔愿闷醋肋调米飞调黔霖峡况放兽停芍骚版澳唤肤梁器早信号转导研究方法信号转导研究方法 每产生一条DNA链，就切断一条探针，每切断一条探针，就产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。 沥啮阐妥邑搞早摘忽宅僚哟熏吏营胶迈糕逆泥既疑敦可掷斑诅讥稻厨乞髓信号转导研究方法信号转导研究方法 5. 蛋白质与DNA相互作用的研究技术: Gel shift (or electrophoretic mobility shift) assay (EMSA)—typically, with smaller DNA sizes. Chromatin-immunoprecipitation (ChIP) assay—to assess occupancy of DNA sites with specific factors in living cells. 葫梗欧怯扛孝奶备忘赵赤秽前挪守刺酞范铰凿屯烘准裴伙坟债首收谅似禹信号转导研究方法信号转导研究方法 盗磺豁优泊宪酪撕沈灶烙淖临齐栽绷撬绒艾捞侦腻饯董野填氓镭秀纵邯卵信号转导研究方法信号转导研究方法 Gel shift 匪柄预貉率淤半蛊辽早汛矣雹呀靛割健捧按革源茎鹅扦米诡蜂她窍怎跟挎信号转导研究方法信号转导研究方法 染色质免疫沉淀技术 （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP） —— 体内分析蛋白质-DNA相互作用 真