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提出问题 * * 纤维素乙醇的生产与未来——酿酒酵母对复合抑制剂响应机理的蛋白素学分析SACCHAROMYCES CEREVISIAE PROTEOME ANALYSIS OF COMPOSITE INHIBITOR RESPONSE MECHANISM 2013级生物信息 朱紫阳 纤维素乙醇（LIGNO-CELLULOSIC BIO-ETHANOL） 纤维素生物质是由纤维素（30-50%），半纤维素（20-40%），和木质素（15-30%）组成的复杂材料。纤维质生物质中的糖以纤维素和半纤维素的形式存在。纤维素中的六碳糖和和玉米淀粉中含有的葡萄糖一样，可以用传统的酵母发酵成乙醇。而半纤维素中含有的糖主要为五碳糖，传统的酵母无法经济地将其转化为乙醇每一种植物的确切成分都不尽相同。纤维素存在于几乎所有的植物生命体中，是地球上最丰富的分子。一直以来，将纤维质生物质转化成乙醇是科学家们面对的巨大挑战。酸、高温等苛刻的条件都曾经被用来尝试将纤维素分子打断、水解成单一的糖。 随着石油资源的逐渐枯竭和环境的日益恶化，大力推广使用可再生能源技术已成为许多国家能源发展战略的重要组成部分，以减少对化石能源的依赖和温室气体的排放。 纤维素乙醇技术，是一种高端的清洁能源技术，因为它可以被用来替代传统的粮食乙醇技术，利用地球上广泛存在的纤维素质生物原料生产清洁的乙醇燃料，被寄予了很高的期望。 酿酒酵母对复合抑制剂响应机理的分析 针对纤维素乙醇发酵过程中对发酵微生物的耐受性的要求，本研究采用定量蛋白质组学的方法，对酿酒酵母在乙醇发酵过程中对复合抑制剂AFP的响应机理进行了研究分析。『在纤维素的预处理过程中，会产生乙酸，糠醛和苯酚类的化合物，这些化合物对后续的微生物发酵过程具有毒害作用，通常被称为抑制剂。』 [1]吕亚金酿酒酵母对复合抑制剂耐受机理的蛋白质组学研[DB/OL],2014 选题实用意义与价值 酿酒酵母(SACCHAROMYCES CEREVISIAE) 属于酵母菌科，是一种单细胞生物，成卵圆形或球型，繁殖方式为出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三种，形态简单但生理复杂，工业上用于酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10ΜM。 酿酒酵母生物科学类用途 Etc… 从酿酒酵母中提取质粒 提取生产核酸类衍生物、辅酶A、细胞色素C、谷胱甘肽和多种氨基酸的原料 可制成酵母片 模式生物 酵母菌作为该实验对象的优势： 1.酵母菌能够在基本培养基上生长,使得实验者能够通过改变环境控制其生长； 2. 通过连锁分析、定位克隆然后测序验证而获得的人类遗传性疾病相关基因的研究中，后者的核苷酸序列与酵母基因的同源性为其功能研究提供了极好的线索。酵母也为高等真核生物提供了一个可以检测的实验系统。例如，可利用异源基因与酵母基因的功能互补以确证基因的功能。利用异源基因与酵母基因的功能，还能使酵母成为其它生物新基因的筛查工具。通过使用特定的酵母基因突变株，对人类cDNA表达文库进行筛选，从而获得互补的克隆。 3.酵母菌的生命周期短,适合经典的遗传学分析,使得在酵母菌 16 条染色体上构建精细的遗传图谱成为可能. ·材料试剂和蛋白质组学实验方法 1:材料：酿酒酵母基因突变菌株及亲代菌株BY4742-Δgir2BY4742-Δtae2，BY4742-Δysp2，BY4742 培养基： 2：a.细胞前处理:取菌液离心，离心条件为：4 °C，8000 r/min，5 min。弃去上清，留细胞沉淀。用PBS 缓冲液洗细胞1~2次：向细胞沉淀中加入PBS溶液，涡旋振荡混匀，离心。离心条件为：4 °C，8000 r/min，5 min。弃去上清，留细胞沉淀. b.蛋白质提取：细胞沉淀磨成细粉状后离心，加入1ml裂解液后摇匀，超声破碎后加入10 μL DNaseI / RNaseA酶混合溶液，涡旋振荡混匀后，，将样品于4 °C冰箱放置20 min。向各样品中分别加入10 μL苯甲基磺酰氯（PMSF）溶液，涡旋振荡混匀后，将样品于4 °C冰箱放置2 h，并于放置过程中不时混匀。将样品离心，取上清。 蛋白质浓度的测定 有机试剂沉淀蛋白质 在线二维液相色谱与串联质谱检测 通过质谱检测和谱图处理，得到储存肽段碎片信息的mgf格式文件，通过Mascot软件在NCBI蛋白质数据库中搜索，得到蛋白质鉴定结果 图文分析总结 结果与分析 对于C0，C1，C2和C3的四代酿酒酵母细胞，我们分别比较了细胞内的蛋白质的表达水平在延滞期和对数期的差异以C0代的细胞中某蛋白质的表达量作为参比，分析该蛋白质在复合抑制剂条件下培养的三代酿酒酵母细胞中的表达量调节。其中，下调倍数低于0.8的蛋白质，和上调倍数高于1.25的蛋白