8.PCT主要生产工艺及反应体系的重点解析.doc

降钙素原（PCT）检测试剂盒（胶体金法） 主要生产工艺及反应体系的研究资料 胶体金免疫检测技术是目前临床快速检测的常用方法之一。广州鸿琪光学科技有限公司结合国内外对降钙素原检测试剂盒在临床诊断中的应用情况开发了降钙素原（PCT）定量检测试剂盒（胶体金法），结合鸿琪公司开发的免疫胶体金读数仪对血清、血浆和全血标本中的降钙素原（PCT）进行定量检测。 反应原理描述 人降钙素原（PCT）检测试剂（胶体金法）是一种不需要任何仪器设备的全血/血清/血浆检测法，采用胶体金免疫层析技术，试剂盒含有被预先包被在玻璃纤维上的胶体金标记的抗PCT单克隆抗体(mAb1)以及固定于膜上测试区（T）的抗PCT单克隆抗体(mAb2)和质控区（C）的相应抗体。 测试时，将标本滴入试剂盒加样孔（S）内, 标本中如含有人降钙素原（PCT），则标本中的人降钙素原（PCT）分别与预先包被在玻璃纤维上的抗PCT单克隆抗体(mAb1)结合，结合物在毛细效应下向上层析，随后会被固定在膜上相应测试区的抗PCT单克隆抗体(mAb2)结合捕获，从而在相应测试区出现紫红色条带。如是阴性标本，则相应测试区内将没有紫红色条带出现。无论标本中是否存在人降钙素原（PCT），一条紫红色条带都会出现在质控区（C）内。质控区（C）内所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。通过金标免疫分析仪检测测试区（T）显色深度，再经过保存在卡壳上二维码上的定标曲线计算得到检测结果。 胶体金标记的基本原理是胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。NC膜包被的基本原理是蛋白首先通过静电作用和硝酸素纤维膜结合，然后靠H键和疏水作用维持长时间结合。 NC膜包被所用的主要原辅料有：硝酸素纤维膜、抗PCT单克隆抗体(mAb2)和羊抗鼠IgG。 二、主要生产工艺的各主要工序流程图 蓝色工序在10万级洁净区内进行，其他工序在普通生产区。 三、主要工序所用主要原辅料、具体步骤即每一步骤的具体实现方法 该产品的生产包括各种工作溶液的配置胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定胶体金标记，检测线及质控线的制备等步骤，并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合。各种工作溶液的配置胶体金标记物、包被抗原或抗体等浓度确定胶体金标记物gG，终浓度为1.0mg/ml。 （三）胶体金标记物的制备采用枸橼酸三钠还原法制备胶体金，胶体金颗粒置28℃保存，在规定的保存期内使用。检测线及质控线的制备取在硝酸纤维素膜上制备检测线取已确定使用的gG，终浓度为1.0mg/ml，用同样方法制备线之间的距离约+0.5mm，线的宽度约0.8-1.0mm；半成品按批号抽取数量的半成品对所抽样的半成品、等性能方面的检测，应符合质量标准（）贴、切、? ?在?温度15～30℃；湿度≤25%条件下，将标记好的玻璃纤维、硝酸纤维膜、聚纸板、吸水纸、样品垫（经特殊处理，可过滤红细胞）等物组装，要求材料附着牢固，膜条切割应宽为4.0±1.0mm，然后装塑料壳。 （七）成品、等性能方面的检测，应符合质量标准 检测线包被浓度 试验设计：固定加液量（喷量1.0μl/cm，电机速度511HZ），用包被缓冲液调整抗PCT单克隆抗体(mAb2)的包被浓度分别为0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ ml、2.0 mg/ ml，分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，分别以降钙素原最低检出量参考品0.1ng/ml和零浓度参考品加样测试，每个浓度参考品平行测试20次。计算零浓度参考品测试的吸光值平均数分别为M0及计算它们的标准差SD，计算0.1ng/ml参考品的测试平均值为M1，若M1M0+2SD，表明最低检测限≤0.1ng/ml（≥95%置信区间）。 试验结果： 包被浓度 M0+2SD M1 0.3mg/ml 0.5mg/ml 1.0mg/ml 2.0mg/ml 2.5mg/ml 结论：当包被浓度分别达到1.0mg/ml， 最低检测限≤0.1ng/ml，而进一步提高包被浓度，这个项目的灵敏度没有明显的改变。最终确定这个项目检测线包被浓度均为1.0 mg/ml。 对照线包被浓度 试验设计：固定加液量（喷量1.0μl/cm，电机速度511HZ），用包被缓冲液调整羊抗鼠IgG抗体浓度为0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.4 mg/ml、1.8mg/ml，分别进行包被，晾干后按正常生产工艺组装试剂条，以阴性标本加样比较不同包被浓度对照线显色时间。 试验结果： 羊抗鼠IgG 对照线显色时间 0.5mg/ml 超过4 m