分子生物学验.docVIP

引物的设计在PCR反应中极为重要，应遵循几条原则：①碱基组成，G﹢C含量应在40～60%②长度，18～25个核苷酸，上下游引物的长度差别不能大于3bp；③不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可能成发夹结构④一个引物的3′末端都不能和其他任何引物互补，否则会形成引物二聚体⑤解链温度（Tm）：计算出两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃，这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性；⑥3′末端，每个因为的3′末端碱基应尽可能为G或C，但又不推荐使用3′末端有……NNCG或……NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以村级发夹结构的形成，还可能产生二聚体；⑦向引物5′末端添加限制性酶切位点，噬菌体启动子等序列，因为位于DNA分子5′末端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以，引物应当超出限制性内切酶识别位点2－3个核苷酸，即至少包含有2－3个保护碱基；⑧ 【实验原理】： 在原核生物中，转化是一种普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处在一种感受状态有很大的关系。所谓感受态是指细胞处于容易吸收外源DNA的状态，它是由受体菌的遗传性所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子等影响。 制备感受态大肠杆菌的方法还有Hanahan方法（用于高效转化）和I