导学案课题3血红蛋白的提取和分离.docx

课题3 血红蛋白的提取和分离一、学习目标：尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理二、重点：凝胶色谱法的原理和方法一、凝胶色谱法 1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。2、原理（1）由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的的 。（2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。二、缓冲溶液1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。三、电泳 1、概念：指 在电厂的作用下发生 的过程。2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。 四、实验操作1、样品处理:通过 、 、 等操作收集血红蛋白溶液。(1)红细胞的洗涤：目的是 。分离时采取 ，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：把 离心后，将试管中的液体用 过滤、除去 ，于 中静置片刻后，分离出下层的 。2、粗分离：即透析(1)方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。(2)目的：将 的杂质除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色谱柱的制作。(2)凝胶色谱柱的装填①材料：本实验使用的是 。②方法：凝胶用 充分溶胀后。配成 ，一次性 倒人色谱柱内。不能有 存在；不能发生 流干露出凝胶颗粒的现象。(3)样品的加入和洗脱①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。b、加样：用 小心地将1mL透析后的样品加到 的顶端，注意不要破坏 。c、加样后：打开下端出口，使样品渗入 内。 ②洗脱：加入 ，打开下端出口，进行 。4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。五、操作提示 1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的 用 加热，加速膨胀。 3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。【探究归纳】人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水? 三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么? 四、凝胶色谱法的原理归纳【例l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是 （2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代。（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是 。（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。互动探究(1)凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗? (2)题目中a和b的分离度与凝胶色谱柱的高度有关吗?(3)除了题目中提到的气泡需要重装以外，还有哪种情况需要重装？5、下面说法不正确的是 ( ) A、在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变 B、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成 C、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 D、透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内6、蛋白质的提取和分离分为哪几步 ( ) A、样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 B、样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C、样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D、样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定7、洗涤红细胞时，离心所采用的方法是A、低速长时间离心 B、低速短时间离心 C、高速长时间离心 D、