molecularclone(quiteuseful!)教程范本.ppt

?? 本实验注意事项： 1．尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10mM的β-ME处理 2．研钵预冻，粉末转管前加CTAB前不要融化 3．24:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的 4．所用试剂必需灭菌，手套 思考： （1）试分析DNA降解的可能原因 （2）提高DNA产量的措施 所用到的试剂及作用（一）： 氯仿/异戊醇（24:1）：氯仿加速有机相与液相分层，去除植物色素，蛋白质和多糖等。异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生，配合使用两有机溶剂，比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。 95%EtOH 沉淀DNA。 10M NH4AC 诱导乙醇沉淀较大DNA。 70%EtOH 去除微量Na+、K+、M2+等阳离子及小分子量的有机分子，洗脱CTAB 所用到的试剂及作用（二）： TE（1mMEDTA，10mM Tris.HCl pH8.0）溶解并长期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子，从而抑制DNase等的活性。 外环境条件： pH8.0防止脱氨作用； 65℃ CTAB中DNase变性，促进内溶物释放； 离心时15℃以防CTAB沉淀而降低DNA量。 DNA质量检测 一．DNA检测常规项目 DNA纯度：紫外分光光度计A260/A280=1.8－2.0，