第四章色谱分离技术..docVIP

《生物分离与纯化技术》授课教案 第四章 色谱分离技术 教学目的： 了解色谱分离技术的特点和应用； 熟悉吸附色谱分离技术的概念、分类、特点及其应用； 熟悉离子交换色谱技术的概念、特点及其应用； 掌握凝胶色谱分离技术的操作及应用； 掌握亲和色谱分离技术常用载体和配基及其制备方法，掌握亲和色谱分离技术的操作； 掌握高效液相色谱分离技术常用的固定相、流动相及其选择方法，掌握高效液相色谱分离技术的操作。 教学重点： 离子交换色谱技术的概念、特点及其应用，凝胶色谱分离技术的操作及应用，亲和色谱分离技术常用载体和配基及其制备方法，高效液相色谱分离技术的操作。 教学难点： 亲和色谱分离技术的操作；高效液相色谱分离技术常用的固定相、流动相及其选择方法。 教学课时：16学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节 概述 一、色谱分离技术的概念 色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 二、色谱分离系统的组成 色谱分离技术的分类 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种： 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等 四、色谱分离技术的特点 1.分离效率高，每米柱长可达几千至几十万的塔板数； 2.应用范围广，从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物3.活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，尤其是对生物大分子样品的分离，是其他方法无法代替的； 4.选择性强； 5.高灵敏度的在线检测，可采用不同的高灵敏度检测器进行连续的在线检测； 6.快速分离； 7.过程自动化操作。 第二节 吸附色谱分离技术 1、原理：利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键的差异而实现分离 2、关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择 3、吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 4、常用的吸附剂： 氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、聚酰胺、硅藻土 5、展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 6、吸附色谱的操作程序 （1）根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 （2）吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 （3）洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 第三节 离子交换色谱分离技术 1、概念：以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法 2、常用的离子交换树脂 （1）葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25 （2）纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列 （3）琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂 （4）Source 系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳离子交换树脂 S系列 阴离子交换树脂 Q系列 （5）MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为Q系列和P系列 第四节 凝胶色谱分离技术 1. 概念：凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（Molecular Sieve Chromatography，MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。 2.凝胶：是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子。当混合物随流动相流经凝胶柱时，较大的分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，它们将与流动相一起首先流出，较小的分子能进入部分凝胶网孔，流出的速度较慢，更小的分子能进入全部凝胶网孔，而最后从凝胶柱中流出。 3.应用：凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。 4.应用举例： （1）去热原 将离子交换树脂制备的无盐水通过羟型D