MTT法检测细胞活力重点解析.ppt

MTT法检测细胞活力 甘肃中医药大学 MTT法目的和意义 检测细胞存活和生长情况 用于评价药物产生的细胞毒作用 原理 四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称MTT 活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。 在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。 活细胞+MTT 琥珀酸脱 氢酶 紫蓝色结晶物 Formazan 贴壁细胞操作步骤 1.??接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积90 ul。 （边缘孔用PBS或空白培养基填充）。 2.??培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板，大约12h），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药10 ul，一般设5个复孔。 3. 5%CO2，37℃孵育分别孵育24小时后，倒置显微镜下观察。 4. 每孔加入10ul MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。 6. 每孔加入100ul二甲基亚砜（置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）  悬浮细胞操作步骤： 1）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约1×104/ml，每孔先加细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔10ul；共100ul加入到96孔板（边缘孔用PBS填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设5个复孔。 2）置37℃，5%CO2孵育24小时，倒置显微镜下观察。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h 4）每孔加三联裂解液（10gSDS，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml）过夜， 第二天早晨置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。 药物的配制 浓度 体积 过滤 MTT的配制 MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。 实验结果统计学处理 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线，专门公式求IC50（半数抑制浓度 ）。或计算抑制率。 OD对照组-OD实验组 抑制率 % = OD对照组 ×100 % 实验结果统计学处理 公式如下： lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率 举例 药物浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001umol/l，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入?计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025 注意事项 1．?选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，