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ELISA 知识简介 主要内容 1.　ELISA的原理 2.　ELISA的类型 3.　ELISA的步骤 4.　注意事项 1、　ELISA的原理 ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础: 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应 的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 2、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在 这种测定方法中有三个必要的试剂： 固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” 酶标记的抗原或抗体，称为结合物 酶反应的底物。 1）双抗体夹心法测抗原 2）双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 3）间接法测抗体 4）竞争法测抗体 5）竞争法测抗原 6）捕获包被法测抗体 7） ABS-ELISA法 3、ELISA步骤（以间接法为例） 2、封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质 溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充 填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再 吸附。 常用封闭剂：1%的BSA; 1%明胶; 脱脂奶粉,比较价 廉，可以高浓度使用（5%）。 将100μl封闭液加入每个酶标孔中，37 ℃60min，之 后洗涤3次，每次3min。 3）加入待检抗体 4、注意事项 1）加样 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本， 加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在 ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意 不可溅出，不可产生气泡。 2）孵育 孵育时要加盖，避免标本蒸发，吸附于孔壁， 难于清洗彻底；孵育时间不宜过长，避免导致非 特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。 3）洗板 每孔加入适量的洗涤液，既保证洗净酶标孔， 又要避免各孔之间液体交叉。 4）显色 显色液一定要现配现用，加样时保证不外流。 另外，反应的温度和时间是影响显色的主要因 素，为了保证实验结果的准确性，必须在合适的 温度下进行，在规定的适当时间内阅读结果。 5）终止 加终止液时避免产生过多气泡，以免导致假阳 性。 * * 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法。 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。 其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。 IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。 ①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色； 1）抗原包被 将待检抗体用PBS做梯度稀释，取100μl，加入酶标板相应的孔中，37 ℃60min，之后洗涤3次，每次3min。 *